构建重组质粒：克隆目的基因

2023-06-24 理论教育版权反馈

【摘要】：（一）目的基因的获得1.方法为实现某一目的基因（靶基因）的转移与表达，首先必须克隆得到该基因。基因克隆的方法很多，目前常用的有三种方法：①构建cDNA文库，筛选目的cDNA；②通过聚合酶链反应方法得到目的基因；③人工化学合成方法制备。以mRNA为模板反转录成DNA。

（一）目的基因的获得

1.方法

为实现某一目的基因（靶基因）的转移与表达，首先必须克隆得到该基因。基因克隆的方法很多，目前常用的有三种方法：①构建cDNA文库，筛选目的cDNA；②通过聚合酶链反应（PCR）方法得到目的基因；③人工化学合成方法制备。

2.制备流程（PCR法）

已知目的基因序列，就可以用PCR法从基因组DNA或cDNA中获得目的基因。人干扰素α2b是由165个氨基酸残基组成的蛋白质，在大肠杆菌中表达的人干扰素α2b除N末端多一个甲硫氨酸残基外，其他与天然品相同。以干扰素α2b为例获取目的DNA，流程如下：

（1）利用Trizol法提取经NDV-F诱导人脐血白细胞的总RNA。

（2）通过Oligo（dT）寡聚纤维素柱获得poly（A）+mRNA，5%～23%蔗糖密度梯度离心提取12S的mRNA。

（3）以mRNA为模板反转录成DNA。

（4）人IFNα2b PCR引物采用计算机辅助设计，并登录GenBank对照无误。上游引物5'-GACGAATTCATGTGTGATCTGCCTCAAACC-3'（含Eco RⅠ酶切位点），下游引物5'-CGCAAGCTTTCATTCCTTACTTCTTAAAC-3'（含Hin dⅢ酶切位点）。

（5）PCR法扩增目的DNA。反应体系如下：模板10～1000 ng基因组，引物10～50 pmol/L，dNTPs 0.2 mmol/L，10×buffer 5 μL，DNA聚合酶1.25～2.5 U，加水至总体积为50 μL。

PCR反应程序包括变性、退火和延伸，30个循环。

（6）PCR产物回收、纯化，进行限制性酶切处理。反应体系如下：PCR产物3μg，10×限制性酶切缓冲液3 μL，各种限制性内切酶10～20 U，10×BSA 3μL，加水至总体积为30μL。

（7）酶切后PCR产物电泳、回收及纯化。

3.注意事项

（1）RNA易受稳定且广泛存在的RNA酶的攻击反应而降解，所以在RNA提取全过程中应创造无RNA酶的环境，要严格避免RNA酶的污染，并设法抑制其活性。

（2）PCR引物设计遵循以下原则：引物长度以15～30个核苷酸为宜；碱基应尽可能随机分布，避免出现嘌呤、嘧啶堆积现象，引物G+C含量应在45%～55%；引物内部无发夹结构，引物间应避免出现二聚体；引物3'端最好选A，不要选T；在引物5'端可加上限制性酶切位点及保护碱基，以便扩增产物进行酶切和克隆。

（二）质粒的提取

1.碱处理法提取质粒试剂准备

（1）溶液Ⅰ：50 mmol/L葡萄糖、25 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）、10 mmol/L EDTA（pH 8.0）。

（2）溶液Ⅱ：0.2 mol/L NaOH、1%SDS。使用前临时配制。

（3）溶液Ⅲ：乙酸钾缓冲液，pH 4.8。

（4）TE：10 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）、1 mmol/L EDTA（pH 8.0）。

（5）苯酚-氯仿-异戊醇（25∶24∶1）。

（6）乙醇（无水乙醇、70%乙醇）。

（7）50×TAE。

（8）溴化乙锭（EB）：10 mg/mL。

（9）RNase A（RNA酶A）：不含DNA酶（DNase）的RNase A 10 mg/mL，TE配制，沸水加热15 min，分装后储存于-20℃。

（10）6×loading buffer（上样缓冲液）：0.25%溴酚蓝、0.25%二甲苯青FF、40%蔗糖水溶液。

（11）1%琼脂糖凝胶：称取1 g琼脂糖于三角烧瓶中，加100 mL 1×TAE，微波炉加热至完全熔化，冷却至60℃左右，加EB母液（10 mg/mL）至终浓度为0.5 μg/mL。（注意：EB为强诱变剂，操作时戴手套。）

2.碱处理法提取质粒pET14b

（1）将含有质粒的菌种接种在LB固体培养基（含50 μg/mL Amp）中，37℃培养12～24 h。用无菌牙签挑取单菌落接种到5 mL LB液体培养基（含50 μg/mL Amp）中，37℃、200 r/min振荡培养约12 h至对数生长后期。

（2）取1.5 mL培养物，置于微量离心管中，室温8000g离心1 min，弃上清液，将离心管倒置，使液体尽可能流尽。

（3）将细菌沉淀重悬于100μL预冷的溶液Ⅰ中，剧烈振荡，使菌体分散混匀。

（4）加200μL新鲜配制的溶液Ⅱ，颠倒数次混匀（不要剧烈振荡），并将离心管放置于冰上2～3 min。

（5）加入150μL预冷的溶液Ⅲ，将管缓慢颠倒数次混匀，出现白色絮状沉淀，可在冰上放置3～5 min。

（6）加入450μL苯酚-氯仿-异戊醇，振荡混匀，4℃12000g离心10 min。

（7）小心移出上清液，置于一新微量离心管中，加入2.5倍体积预冷的无水乙醇，混匀，室温放置2～5 min，4℃12000g离心15 min。

（8）用1 mL预冷的70%乙醇洗涤沉淀1～2次，4℃8000g离心7 min，弃上清液，将沉淀在室温下晾干。

（9）沉淀溶于20 μL TE（含RNase A 20μg/mL），37℃水浴30 min以降解RNA分子，-20℃保存备用。

3.注意事项

（1）质粒提取过程中应尽量保持低温。

（2）提取质粒DNA过程中除去蛋白质很重要，采用苯酚-氯仿去除蛋白质效果较单独用苯酚或氯仿好，要将蛋白质尽量除干净需多次抽提。

（3）沉淀DNA通常使用冰乙醇，在低温条件下放置时间稍长可使DNA沉淀完全。沉淀DNA也可用异丙醇（一般使用等体积），且沉淀完全，速度快，但常把盐沉淀下来，所以多数还是用乙醇。

（4）溶液Ⅱ为裂解液，使细胞膜裂解，故离心管中菌液逐渐变清；溶液Ⅲ为中和溶液，此时质粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物。

（三）质粒DNA双酶切及琼脂糖电泳回收

1.表达载体的限制性内切酶酶切

反应体系如下：载体3 μg，10×限制性酶切缓冲液3μL，各种限制性内切酶10～20 U，10×BSA 3μL，加水至总体积为30 μL。酶切完全后，在反应体系中进行去磷酸化处理。

2.酶切后表达载体琼脂糖凝胶电泳检测

（1）制备1%琼脂糖凝胶：称取1.0 g琼脂糖，置于三角瓶中，加入100 mL 1×TAE，瓶口上倒扣小烧杯。微波炉加热煮沸3次至琼脂糖全部熔化，摇匀，即成1.0%琼脂糖凝胶液。冷却到65℃左右，向琼脂糖凝胶溶液中加入0.5μLGoldview，摇匀。

（2）胶板制备：将电泳槽内的有机玻璃内槽（制胶槽）洗干净、晾干，放入制胶玻璃板。用透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好，形成模子。将内槽置于水平位置，并在固定位置放好梳子。将冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶液混匀，小心地倒入内槽玻璃板上，使胶液缓慢展开，直到整个玻璃板表面形成均匀胶层。室温下静置直至凝胶完全凝固，垂直轻拔梳子，取下胶带，将凝胶及内槽放入电泳槽中。添加1×TAE电泳缓冲液至没过胶板为止。

（3）加样：在点样板或石蜡膜上混合DNA样品和上样缓冲液，上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1×。用10μL微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内，每加完一个样品，应更换一个加样头，以防污染，加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面。（注意：加样前要先记下加样的顺序。）

（4）电泳：加样后的凝胶板立即通电进行电泳，电压60～100 V，样品由负极（黑色）向正极（红色）方向移动。电压升高，琼脂糖凝胶的有效分离范围降低。当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1 cm处时，停止电泳。

（5）电泳完毕后，取出凝胶。

（6）观察照相：在紫外灯下观察，若有DNA存在则显示出红色荧光条带，采用凝胶成像系统拍照保存。

3.胶回收酶切产物

（1）在紫外检测仪下观察，切下目的DNA，加等体积Tris-HCl饱和苯酚，-20℃放置5 min；

（2）4℃10000g离心5 min，转移上层液，用等体积苯酚-氯仿抽提一次；

（3）加入1/10体积3 mol/L NaAc溶液，混匀，加入2.5倍体积预冷无水乙醇，-20℃静置10 min；

（4）4℃13000g离心10 min，用75%乙醇洗沉淀1～2次；

（5）加双蒸水或TE溶解沉淀。

（四）载体质粒与外源DNA连接

1.实训过程