选择合适的pH及适当浓度的三氯乙酸或丙酮，可以从蛋清中除去大量的非卵类黏蛋白，获得鸡卵类黏蛋白的粗提液。初步纯化的鸡卵类黏蛋白，经DEAE-纤维素离子交换柱进一步纯化，可除去少量的杂蛋白，得到鸡卵类黏蛋白的纯溶液。鸡卵类黏蛋白在280nm处的消光系数=4.13，即蛋白质浓度为1mg/mL时溶液的吸光度A280=0.413，据此可以测定鸡卵类黏蛋白的含量。将收集的蛋白液体放置冰箱，准备进一步用DEAE-纤维素柱层析纯化。......
2023-11-06
分离纯化与质量检验的最佳实践
【摘要】：为防止发酵液中的有机、无机杂质对过滤和对四环素沉淀法提炼的影响，在发酵液酸化处理时，加入黄血盐和硫酸锌等纯化剂，除去发酵液中的蛋白质、铁离子，并加入硼砂，提高滤液的质量。差向四环素的存在严重地降低了四环素产品的品质。目前在生产中减少四环素成品中差向异构物的方法是通过形成复盐而纯化四环素成品。
（一）四环素的提取工艺
（二）提取工艺要点
1.发酵液的预处理
四环素发酵液预处理的主要操作是酸化，一般用草酸进行酸化，但草酸会促使四环素的差向异构化，并且价格高，故酸化时要低温，操作要快，草酸尽量加以回收。为防止发酵液中的有机、无机杂质对过滤和对四环素沉淀法提炼的影响，在发酵液酸化处理时，加入黄血盐和硫酸锌等纯化剂，除去发酵液中的蛋白质、铁离子，并加入硼砂，提高滤液的质量。为了进一步提高四环素、土霉素的质量，在这两种抗生素发酵液的滤液中加入122（Ⅱ型）弱酸性酚醛树脂，可以进一步除去滤液中的色素杂质和某些有机杂质。
2.沉淀提取法
四环素在碱性环境中能和钙、镁、钡等形成复合物而沉淀。
3.溶剂萃取法
四环素类抗生素在碱性条件下，能和一些长烃链的季铵碱形成复盐，难溶于水，而易溶于有机溶剂中。
4.减少差向异构物的方法
四环素的差向异构物不是在四环素的发酵中产生的，而是在四环素的提取和精制过程中产生的。差向四环素的存在严重地降低了四环素产品的品质。故在四环素的提取精制过程中，要防止差向四环素的产生。常用的方法有降低操作温度、缩短操作时间、除去能促进差向异构化的阳离子、选择合适的pH。目前在生产中减少四环素成品中差向异构物的方法是通过形成复盐而纯化四环素成品。
1.确定需要哪些仪器设备及药品。
2.制定详细的四环素分离提取的工艺流程并分离提取。
（三）鉴别试验
1.浓硫酸反应
四环素类抗生素遇硫酸立即产生各种颜色，可据此区别各种四环素类抗生素。
2.三氯化铁反应
本类抗生素分子结构中具有酚羟基，遇三氯化铁试液即显色。
3.薄层色谱法
采用硅藻土作载体，为了获得较好的分离，在黏合剂中加聚乙二醇400、甘油以及中性的EDTA缓冲液。EDTA可以克服因痕量金属离子存在而引起的斑点拖尾现象。
4.特殊杂质检查
（1）有关物质 四环素类抗生素中的有关物质主要是指在生产和储藏过程中易形成的异构杂质、降解杂质（ETC、ATC、EATC）等。中国药典和USP（25）、BP（2000）均采用高效液相色谱法控制四环类抗生素的有关物质。
（2）杂质吸收度 四环类抗生素多为黄色结晶性粉末，而异构体、降解产物颜色较深，此类杂质的存在均可使四环素类抗生素的色泽变深。因此，中国药典和BP（2000）均规定了一定溶剂、一定浓度、一定波长下杂质吸光度的限量。
1.确定需要哪些仪器设备及药品。
2.制定详细的四环素鉴别方案并实施。
（四）含量测定
对于四环素类抗生素的含量测定，目前各国药典多采用高效液相色谱法。
1.确定需要哪些仪器设备及药品。
2.制定出详细的四环素含量测定方法并实施。
（二）提取工艺要点
1.发酵液的预处理
四环素发酵液预处理的主要操作是酸化，一般用草酸进行酸化，但草酸会促使四环素的差向异构化，并且价格高，故酸化时要低温，操作要快，草酸尽量加以回收。为防止发酵液中的有机、无机杂质对过滤和对四环素沉淀法提炼的影响，在发酵液酸化处理时，加入黄血盐和硫酸锌等纯化剂，除去发酵液中的蛋白质、铁离子，并加入硼砂，提高滤液的质量。为了进一步提高四环素、土霉素的质量，在这两种抗生素发酵液的滤液中加入122（Ⅱ型）弱酸性酚醛树脂，可以进一步除去滤液中的色素杂质和某些有机杂质。
2.沉淀提取法
四环素在碱性环境中能和钙、镁、钡等形成复合物而沉淀。
3.溶剂萃取法
四环素类抗生素在碱性条件下，能和一些长烃链的季铵碱形成复盐，难溶于水，而易溶于有机溶剂中。
4.减少差向异构物的方法
四环素的差向异构物不是在四环素的发酵中产生的，而是在四环素的提取和精制过程中产生的。差向四环素的存在严重地降低了四环素产品的品质。故在四环素的提取精制过程中，要防止差向四环素的产生。常用的方法有降低操作温度、缩短操作时间、除去能促进差向异构化的阳离子、选择合适的pH。目前在生产中减少四环素成品中差向异构物的方法是通过形成复盐而纯化四环素成品。
1.确定需要哪些仪器设备及药品。
2.制定详细的四环素分离提取的工艺流程并分离提取。
（三）鉴别试验
1.浓硫酸反应
四环素类抗生素遇硫酸立即产生各种颜色，可据此区别各种四环素类抗生素。
2.三氯化铁反应
本类抗生素分子结构中具有酚羟基，遇三氯化铁试液即显色。
3.薄层色谱法
采用硅藻土作载体，为了获得较好的分离，在黏合剂中加聚乙二醇400、甘油以及中性的EDTA缓冲液。EDTA可以克服因痕量金属离子存在而引起的斑点拖尾现象。
4.特殊杂质检查
（1）有关物质 四环素类抗生素中的有关物质主要是指在生产和储藏过程中易形成的异构杂质、降解杂质（ETC、ATC、EATC）等。中国药典和USP（25）、BP（2000）均采用高效液相色谱法控制四环类抗生素的有关物质。
（2）杂质吸收度 四环类抗生素多为黄色结晶性粉末，而异构体、降解产物颜色较深，此类杂质的存在均可使四环素类抗生素的色泽变深。因此，中国药典和BP（2000）均规定了一定溶剂、一定浓度、一定波长下杂质吸光度的限量。
1.确定需要哪些仪器设备及药品。
2.制定详细的四环素鉴别方案并实施。
（四）含量测定
对于四环素类抗生素的含量测定，目前各国药典多采用高效液相色谱法。
1.确定需要哪些仪器设备及药品。
2.制定出详细的四环素含量测定方法并实施。
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2023-11-06
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