初级分离阶段的任务是分离细胞和培养液，破碎细胞和释放干扰素，浓缩产物和除去大部分杂质。（一）干扰素分离工艺过程菌体裂解用纯化水配制裂解缓冲液，置于冷室内，降温至2～10℃。采用盐浓度线性梯度5～50 mS/cm进行洗脱，配合SDS-PAGE收集干扰素峰，在2～10℃下进行。合并干扰素部分，最终蛋白质浓度应为0.1～0.2 mg/mL。无菌过滤分装用0.22 μm滤膜过滤干扰素溶液，分装后，于-20℃以下的冰箱中保存。......
2023-06-24
槐花米中芦丁及槲皮素的提取分离及鉴定实训项目
【摘要】：芦丁可被稀酸水解生成槲皮素及葡萄糖、鼠李糖，依此制备槲皮素。通过纸色谱及紫外光谱进行黄酮及糖的鉴定。绘制芦丁的标准曲线，计算提取的芦丁的纯度。（三）芦丁和槲皮素鉴定1.芦丁的定性反应取芦丁适量，加乙醇使其溶解，分成三份，供下述试验用。
一、实训目标
（1）通过芦丁的提取与精制，掌握碱酸法提取黄酮类化合物的原理及操作。
（2）掌握槲皮素的制备原理及操作。
（3）熟悉紫外光谱在黄酮结构鉴定中的应用。
（4）通过芦丁的结构分析，了解苷类结构研究的一般程序和方法。
二、实训原理
芦丁（rutin）广泛存在于植物界中，现已发现含芦丁的植物在70种以上，如烟叶、槐花、荞麦和蒲公英中均含有。以槐花米（为植物槐Sophora japonica L.的未开放的花蕾）和荞麦中芦丁含量最高，可作为大量提取芦丁的原料。芦丁是由槲皮素（quercetin）3位上的羟基与芸香糖（L-鼠李糖-1α-6L-葡萄糖）脱水缩合形成的苷，故又叫芸香苷。
芦丁分子式为C27H30O16·3H2O，为浅黄色针状晶体，熔点为174～178℃（含三分子水）、188℃（无水物）。难溶于冷水（1∶（8000～10000）），可溶于热水（1∶（180～200））、热甲醇（1∶10）、冷甲醇（1∶100）、热乙醇（1∶60）、冷乙醇（1∶650），难溶于乙醚、氯仿、石油醚、乙酸乙酯、丙酮等，易溶于碱液。
槲皮素分子式为C15 H10 O7·2H2O，为黄色晶体，熔点为313～314℃（2分子结晶水）、316℃（无水物）。能溶于冷乙醇（1∶290），易溶于沸乙醇（1∶23），可溶于甲醇、乙酸乙酯、冰乙酸、吡啶、丙酮等，难溶于水、苯、石油醚等溶剂。
芦丁为黄酮苷，分子中具有酚羟基，显酸性，可溶于稀碱液中，在酸液中沉淀析出，可利用此性质进行提取分离。利用芦丁易溶于热水、热乙醇，较难溶于冷水、冷乙醇的性质，选择重结晶方法进行精制。芦丁可被稀酸水解生成槲皮素及葡萄糖、鼠李糖，依此制备槲皮素。通过纸色谱及紫外光谱进行黄酮及糖的鉴定。
三、实训仪器和药品
1.仪器
索氏提取器、烧杯（100 mL）、酒精灯、普通漏斗、布氏漏斗、吸滤瓶、比色管（25 mL）。
2.药品
盐酸、石灰乳、乙醚、氯化钠、95%乙醇。
3.材料
TLC薄板、温度计（373 K）、滤纸。
四、实训方法和步骤
（一）芦丁的制备
（二）槲皮素的制备
（二）槲皮素的制备
（三）芦丁和槲皮素鉴定
1.芦丁的定性反应
取芦丁适量，加乙醇使其溶解，分成三份，供下述试验用。
（1）盐酸-镁粉试验 取样品液适量，加2滴浓盐酸，再酌加少许镁粉，即产生剧烈的反应，并逐渐出现红色至深红色。
（2）锆-柠檬酸试验 取样品液适量，然后加2%ZrOCl2的甲醇溶液，注意观察颜色变化，再加入2%柠檬酸的甲醇溶液，并详细记录颜色变化。
（3）α-萘酚-浓硫酸反应 取样品液适量，加等体积的10%α-萘酚的乙醇溶液，摇匀，沿管壁缓加浓硫酸，注意观察两液界面的颜色。
2.芦丁浓度测定
（1）标准曲线的绘制 称取在105℃干燥至恒重的芦丁对照品10 mg，用95%乙醇溶解，摇匀，定容至10 mL，使之成为浓度为1 mg/mL的芦丁标准品溶液，作为储备液。量取上述溶液0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL，分别加水至3 mL，加5%亚硝酸钠溶液0.5 mL。放置6 min，加10%硝酸铝溶液0.5 mL，摇匀，放置6 min后加5%氢氧化钠溶液2.5 mL，混匀，放置15 min后用蒸馏水定容至10 mL。用紫外分光光度计在500 nm波长处测吸光度，以对照品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，作标准曲线。
（2）样品含量的测定 采用紫外分光光度计，精密称取样品2.5 mg，加95%乙醇溶解，于5.0 mL容量瓶中稀释至刻度，摇匀。吸取1.0 mL于25 mL容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀，取1.0 mL 95%乙醇同样稀释，作为空白对照，在500 nm波长处测定吸光度，由回归方程计算出产品中芦丁的纯度。
3.芦丁及槲皮素的色谱
（1）支持剂：中速层析滤纸（5 cm×20 cm）。
（2）展开剂：正丁醇-乙酸-水（4∶1∶5）。
（3）样品：自制槲皮素的乙醇溶液，自制芦丁的乙醇溶液。
（4）对照品：槲皮素标准品的乙醇溶液，芦丁标准品的乙醇溶液。
（5）显色剂：三氯化铝乙醇溶液喷雾。
4.糖的纸色谱检识
（1）支持剂：中速层析滤纸（5 cm×20 cm）。
（2）样品：取水解后的滤液10 mL，水浴加热，且在搅拌下加适量碳酸钡细粉至pH为7，过滤，取滤液并浓缩至2 mL左右，放冷后，供纸色谱点样用。
（3）对照品：1%葡萄糖标准品醇溶液及1%鼠李糖标准品醇溶液。
（4）展开剂：正丁醇-乙酸-水（4∶1∶5）上层。
（5）显色剂：喷以邻苯二甲酸苯胺溶液，105℃烘烤约5 min至斑点显色清晰。
五、实训结果处理
（1）判断芦丁和槲皮素提取的效果。
（2）绘制芦丁的标准曲线，计算提取的芦丁的纯度。
六、知识和技能探究
（1）提取总黄酮时，为何要将沸水加至槐花米中，而不是将槐花米直接加入冷水中逐渐升温加热？能否有其他方法起同样的作用？
（2）芦丁水解过程有什么现象发生？请说明原因。
（3）芦丁和槲皮素的硅胶色谱与聚酰胺色谱中Rf值有何变化？试根据色谱原理作出解释。
（4）试述紫外光谱在黄酮类化合物结构鉴定中的应用。
（三）芦丁和槲皮素鉴定
1.芦丁的定性反应
取芦丁适量，加乙醇使其溶解，分成三份，供下述试验用。
（1）盐酸-镁粉试验 取样品液适量，加2滴浓盐酸，再酌加少许镁粉，即产生剧烈的反应，并逐渐出现红色至深红色。
（2）锆-柠檬酸试验 取样品液适量，然后加2%ZrOCl2的甲醇溶液，注意观察颜色变化，再加入2%柠檬酸的甲醇溶液，并详细记录颜色变化。
（3）α-萘酚-浓硫酸反应 取样品液适量，加等体积的10%α-萘酚的乙醇溶液，摇匀，沿管壁缓加浓硫酸，注意观察两液界面的颜色。
2.芦丁浓度测定
（1）标准曲线的绘制 称取在105℃干燥至恒重的芦丁对照品10 mg，用95%乙醇溶解，摇匀，定容至10 mL，使之成为浓度为1 mg/mL的芦丁标准品溶液，作为储备液。量取上述溶液0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL，分别加水至3 mL，加5%亚硝酸钠溶液0.5 mL。放置6 min，加10%硝酸铝溶液0.5 mL，摇匀，放置6 min后加5%氢氧化钠溶液2.5 mL，混匀，放置15 min后用蒸馏水定容至10 mL。用紫外分光光度计在500 nm波长处测吸光度，以对照品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，作标准曲线。
（2）样品含量的测定 采用紫外分光光度计，精密称取样品2.5 mg，加95%乙醇溶解，于5.0 mL容量瓶中稀释至刻度，摇匀。吸取1.0 mL于25 mL容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀，取1.0 mL 95%乙醇同样稀释，作为空白对照，在500 nm波长处测定吸光度，由回归方程计算出产品中芦丁的纯度。
3.芦丁及槲皮素的色谱
（1）支持剂：中速层析滤纸（5 cm×20 cm）。
（2）展开剂：正丁醇-乙酸-水（4∶1∶5）。
（3）样品：自制槲皮素的乙醇溶液，自制芦丁的乙醇溶液。
（4）对照品：槲皮素标准品的乙醇溶液，芦丁标准品的乙醇溶液。
（5）显色剂：三氯化铝乙醇溶液喷雾。
4.糖的纸色谱检识
（1）支持剂：中速层析滤纸（5 cm×20 cm）。
（2）样品：取水解后的滤液10 mL，水浴加热，且在搅拌下加适量碳酸钡细粉至pH为7，过滤，取滤液并浓缩至2 mL左右，放冷后，供纸色谱点样用。
（3）对照品：1%葡萄糖标准品醇溶液及1%鼠李糖标准品醇溶液。
（4）展开剂：正丁醇-乙酸-水（4∶1∶5）上层。
（5）显色剂：喷以邻苯二甲酸苯胺溶液，105℃烘烤约5 min至斑点显色清晰。
五、实训结果处理
（1）判断芦丁和槲皮素提取的效果。
（2）绘制芦丁的标准曲线，计算提取的芦丁的纯度。
六、知识和技能探究
（1）提取总黄酮时，为何要将沸水加至槐花米中，而不是将槐花米直接加入冷水中逐渐升温加热？能否有其他方法起同样的作用？
（2）芦丁水解过程有什么现象发生？请说明原因。
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