白细胞介素-2的优化生产技术

2023-06-24 理论教育版权反馈

【摘要】：白细胞介素由白细胞产生又在白细胞间发挥作用，因此得名，并沿用至今。目前已发现IL-1～IL-33，共计33种白细胞介素，它们在免疫细胞的成熟、活化、增殖和免疫调节等一系列过程中均发挥重要作用，参与其他细胞间的相互作用，并且与机体的多种生理及病理反应有密切的关系。

一、生产前准备

（一）查找资料，了解白细胞介素-2生产的基本知识

白细胞介素是由多种细胞产生并作用于多种细胞的一类细胞因子。白细胞介素由白细胞产生又在白细胞间发挥作用，因此得名，并沿用至今。1979年第二届国际淋巴因子专题会议将免疫应答过程中白细胞间相互作用的细胞因子统一命名为白细胞介素（interleukin，IL），在名称后加阿拉伯数字编号以示区别。目前已发现IL-1～IL-33，共计33种白细胞介素，它们在免疫细胞的成熟、活化、增殖和免疫调节等一系列过程中均发挥重要作用，参与其他细胞间的相互作用，并且与机体的多种生理及病理反应有密切的关系。

目前，除部分白细胞介素进入临床研究阶段以外，白细胞介素-2（IL-2）、白细胞介素-6（IL-6）和白细胞介素-12（IL-12）三种已在国内上市并在临床上得到应用，其中IL-2是应用最早的白细胞介素品种。

IL-2在pH2～9范围内稳定，56℃加热1 h仍有活性，但65℃加热30 min即逐渐失去活性。它对各种蛋白酶敏感，对核酸酶不敏感。IL-2主要由T淋巴细胞（特别是CD4+T淋巴细胞）受抗原或丝裂原刺激后合成；B淋巴细胞、NK细胞及单核-巨噬细胞也能产生IL-2。IL-2相对分子质量为1.5×104，是含有113个氨基酸残基的糖蛋白，在人类由第4号染色体上的一个基因编码。IL-2具有一定的种属特异性，人类细胞只对灵长类来源的IL-2起反应，而几乎所有种属动物的细胞均对人的IL-2敏感。IL-2的靶细胞包括T淋巴细胞、NK细胞、B淋巴细胞及单核-巨噬细胞等。这些细胞表面均可表达IL-2受体（IL-2r）。

IL-2具有刺激T系细胞并产生细胞因子、诱导杀伤细胞产生细胞因子并增强相关基因表达、刺激和调节B淋巴细胞、活化巨噬细胞的功能。因此，IL-2在临床上具有调整免疫功能的重要作用，常用于感染性疾病、免疫功能不全以及癌症等疾病的综合治疗，对创伤修复也有一定疗效。

传统的生产方法是从白细胞中提取制备IL-2。随着人类对IL-2的认识不断深入以及现代生物技术的不断发展，IL-2已在基因工程技术基础上大规模生产。IL-2生产用的宿主菌为大肠杆菌，注射用IL-2是由具有高效表达IL-2基因的大肠杆菌，经发酵、分离和高度纯化后获得的重组人IL-2冻干制成的。生产和检定用设施、原料及辅料、水、器具、动物等必须符合国家有关规定和要求。

（二）确定生产技术、生产菌种和工艺路线

（1）确定生产技术：发酵法生产IL-2技术。

（2）确定生产菌种：重组IL-2工程菌株（带有人IL-2基因的重组质粒转化的大肠杆菌菌株）。

（3）确定生产工艺路线，如图1-10-5所示。

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图1-10-5　重组IL-2生产工艺路线

二、生产工艺过程

（一）种子批的制备

重组IL-2工程菌株为带有人IL-2基因的重组质粒转化的大肠杆菌菌株。

按照《生物制品生产检定用菌毒种管理规程》的规定建立生产用种子批。种子采用LB培养基以摇瓶制备，30℃培养时间10 h，供发酵罐接种用。

生产用的主种子批和工作种子批应以划种LB琼脂平板的方法确定大肠杆菌的集落形态以及是否有其他杂菌。并应对菌种进行染色镜检以确定生产菌种为典型的革兰氏阴性杆菌；抗生素的抗性检测要与原始菌种一致；电镜观察（工作种子批可免做）应为典型的大肠杆菌形态，无支原体、病毒样颗粒及其他微生物污染，符合大肠杆菌生物学性状；摇床中培养的菌种，人IL-2表达量应高于原始菌种，质粒的酶切图谱应与原始重组质粒的一致；目的基因核苷酸序列应与批准序列相符。

（二）发酵生产

采用不含任何抗生素的M9CA培养基于发酵罐中灭菌后接入摇瓶种子，30℃发酵10 h。培养液中的细胞浓度达到要求后，升高培养温度至42℃，诱导3 h左右，完成发酵。

（三）制备

（1）包含体制备　离心收集菌体，悬浮于含1 mmol/L EDTA的50 mmol/L Tris-HCl溶液（pH 8.0）中。超声波破碎菌体3次，并用显微镜观察细胞破碎情况。待细胞破碎良好后，8000 r/min离心15 min，收集沉淀。

（2）包含体洗涤及裂解　收集的包含体沉淀先用10 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）洗涤3次，分别以8000 r/min离心15 min。沉淀再用4 mol/L尿素溶液洗涤2次，收集沉淀。最后用含1 mmol/L EDTA的50 mmol/L Tris-HCl（pH 6.8）悬浮沉淀，并加入盐酸胍至终浓度6 mol/L，水浴加热至60℃维持15 min，不断搅拌，然后12000 r/min离心10 min，收集上清液。

（3）凝胶过滤及复性　上清液经过已用0.1 mol/L乙酸铵、1%SDS和2 mmol/L巯基乙醇（pH 7.0）平衡过夜的Sephacryl S-200柱吸附后，用平衡液洗脱，收集IL-2活性组分。

用乙酸铵缓冲液（pH7.0）、2 mol/L硫酸铜复性，得到IL-2纯品。

（4）配制　经检测符合有关规定的纯品，即为人IL-2原液，除菌过滤后于适宜温度保存。将检定合格的加入了稳定剂的人IL-2原液用稀释液稀释至所需浓度，除菌过滤后即为半成品。半成品检定合格之后，按照《生物制品分批规程》、《生物制品分装和冻干规程》和《生物制品包装规程》等国家的有关规定，进行分批、分装、冻干和包装等。

成品应于2～8℃避光保存和运输，自生产之日起，按批准的有效期执行。

（四）质量检定

1.原液检定

原液须按照规定进行生物活性、蛋白质含量检测。原液的比活力为生物活性与蛋白质含量之比，1 mg蛋白质应不低于1.0×107IU。原液的纯度可用电泳和高效液相色谱法进行检测，人IL-2纯度应不低于95.0%。原液中人IL-2的相对分子质量采用还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测，为1.55×104±1.6×103。原液中外源性DNA残留量每支应不高于10 ng，宿主菌蛋白质残留量应低于总蛋白质的0.10%。原液中不应含有残余氨苄西林或者其他抗生素活性。原液中细菌内毒素每106IU应小于10 EU。原液等电点检测主区带应为6.5～7.5，且供试品的等电点与对照品的等电点图谱一致。用水或生理盐水将供试品稀释至100～500 μg/mL，在1 cm光径、230～360 nm波长下进行扫描，最大吸收峰波长应为（277±3）nm。肽图检测，应与对照品图形一致。用氨基酸序列分析仪测定，N末端氨基酸序列为：（Met）-Ala-Pro-Thr-Ser-Ser-Ser-Thr-Lys-Lys-Thr-Gln-Leu-Gln-Leu-Glu。

2.半成品检定

半成品检定项目包括细菌内毒素检查和无菌检查，结果应符合规定。

3.成品检定

成品首先应进行鉴别试验，采用免疫印迹法或免疫斑点法，结果应为阳性。

成品外观应为白色或微黄色疏松体，加入标示量注射用水后应迅速复溶为澄清、透明液体。异物检查和装量差异检测均应符合规定。

成品水分含量应不高于3.0%，pH应为6.5～7.5，如不含SDS，则应为3.5～7.0。渗透压、浓度应符合标准的要求。成品检定除水分、装量差异测定外，应按标示量加入灭菌注射用水，复溶后进行其余各项目的检定。

成品的生物活性应为标示量的80%～150%。成品中不应有残余氨苄西林或其他抗生素活性，无菌检查应符合规定。成品中细菌内毒素每支应小于10 EU，异常毒性检查应符合规定。成品中乙腈残留量应不高于0.0004%。

白细胞介素-2的优化生产技术

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