乙型肝炎疫苗的生产及优化措施

2023-06-24 理论教育版权反馈

【摘要】：接种乙肝疫苗是预防和控制乙型肝炎的根本措施。乙型肝炎疫苗的研制先后经历了血源性疫苗和基因工程疫苗阶段。因此，现阶段基因工程乙肝疫苗已成为控制乙肝流行的主要疫苗。基因工程乙肝疫苗技术目前已相当成熟，我国自行研制的疫苗经多年观察证明安全有效，已获批生产。确定乙肝基因工程疫苗生产工艺路线，如图1-10-4所示。

一、生产前准备

（一）查找资料，了解乙型肝炎疫苗生产的基本知识

1.乙型肝炎和乙型肝炎疫苗

乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）引起的一种世界性疾病，也是病毒性肝炎中最严重的一种。据统计，全世界无症状乙肝病毒携带者（HBsAg携带者）超过2.8亿，我国是高发区，约有1.5亿，其中50%～70%的人群有过乙型肝炎病毒的感染（未加免疫的人群），8%～10%为慢性乙型肝炎病毒表面抗原携带者，多数无症状，其中1/3出现肝损害的临床表现。目前我国有乙肝患者3000万。接种乙肝疫苗是预防和控制乙型肝炎的根本措施。

乙型肝炎疫苗的研制先后经历了血源性疫苗和基因工程疫苗阶段。血源性乙肝疫苗因其原料来源而有一些自身无法克服的缺点，基因工程乙肝疫苗与血源性乙肝疫苗相比有许多不可比拟的优势。因此，现阶段基因工程乙肝疫苗已成为控制乙肝流行的主要疫苗。基因工程乙肝疫苗技术目前已相当成熟，我国自行研制的疫苗经多年观察证明安全有效，已获批生产。

2.生产工艺

目前我国生产的乙肝疫苗为基因重组乙肝疫苗。多采用哺乳动物细胞和重组酵母（酿酒酵母和汉逊酵母）等高效表达系统生产乙肝疫苗。

（1）乙肝基因工程（CHO）疫苗　用基因工程技术将乙型肝炎表面抗原基因片段重组到中国仓鼠卵巢细胞（CHO）内，通过对细胞培养增殖，分泌乙肝表面抗原（HBsAg）于培养液中，经纯化加佐剂氢氧化铝后制成。

（2）重组酵母乙肝疫苗　利用现代基因工程技术，构建含有乙肝病毒表面抗原基因的重组质粒，经此重组质粒转化的酵母能在繁殖过程中产生乙肝病毒表面抗原，经破碎酵母菌体，释放的乙肝病毒表面抗原经纯化、灭活加佐剂氢氧化铝后制成乙肝疫苗。

（二）确定生产技术、生产细胞株和工艺路线

（1）确定生产技术：动物细胞培养制药技术。

（2）确定生产细胞株：重组CHO细胞C28株。

（3）确定乙肝基因工程（CHO）疫苗生产工艺路线，如图1-10-4所示。

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图1-10-4　乙肝基因工程（CHO）疫苗生产工艺流程

二、生产工艺过程

（一）获取重组CHO细胞

国内生产重组CHO细胞乙肝疫苗所用细胞种子为重组CHO细胞C28株，该株是利用DNA操作技术将编码HBsAg的基因拼接入CHO细胞染色体中而获得。

（二）转瓶细胞培养

将形成的致密单层种子细胞用胰酶消化成疏松状态，加生长液吹打均匀。细胞悬液按一定比例接种到15 L转瓶，加生长液摇匀，37℃培养。形成单层后，每2 d换一次维持液，收获细胞原液。

细胞原液在含有适量灭活新生牛血清的DMEM培养液中连续三次传代培养。传代细胞中加入少许胰酶消化，待细胞呈松散状态时弃去胰酶，加入生长液，分别接种于15 L转瓶中，静置或转瓶培养细胞。培养期间以含有新生牛血清的DMEM培养液维持细胞生长和HBsAg的表达。

（三）收集培养液

待表达HBsAg含量达到1.0 mg/L以上时收获上清液。维持期内大约每2 d收获一次细胞培养液。上清液需做无菌检查，并于2～8℃保存。

（四）HBsAg的提纯

培养液用离心机进行澄清处理后，可采用以下两种技术路线提纯HBsAg。

（1）沉淀-超速离心-凝胶过滤法　上清液以50%（NH4）2SO4饱和溶液沉淀，沉淀物溶解后再以50%（NH4）2SO4饱和溶液沉淀，沉淀用生理盐水溶解后超滤，进行两次KBr等密度区带超速离心（25000 r/min），分步收集合并密度梯度离心液中HBsAg特异活性峰。过Sepharose 4B柱层析，分步收集合并洗脱液中HBsAg富集峰，超滤透析后再经超速离心，分步收集合并，即制得精制HBsAg。

（2）三步层析法　培养上清液经过Butyl-s-Sepharose FF为介质的疏水层析（HIC）、以DEAE-Sepharose FF为介质的阴离子交换层析（IEC）和以Sepharose 4FF为介质的凝胶过滤层析，制得精制HBsAg。

（五）超滤、浓缩、除菌过滤、吸附、分装

以上两法纯化获得的HBsAg，按200μg/mL的终浓度加入甲醛，于37℃保温72 h，再经超滤、浓缩及除菌过滤后得到原液。原液吸附氢氧化铝佐剂并加入防腐剂成为半成品，经分包装即为成品。

（六）质量检定

（1）物理性状　成品外观应为乳白色混悬液体，可因沉淀而分层，易摇散，不应有摇不散的块状物。装量不应低于标示量。pH应为5.5～6.8。

（2）效价　将疫苗连续稀释，每个稀释度接种4～5周龄未孕雌性NIH或BALB/c小鼠20只，每只腹腔注射1.0 mL，用参考疫苗做平行对照，4～6周后采血，采用酶联免疫法或其他适宜方法测定抗-HBs。计算ED50，供试品ED50（稀释度）/参考疫苗ED50（稀释度）之值应不低于1.0。

（3）杂质　产品应做无菌检查、异常毒性检查，结果应符合有关规定。细菌内毒素检查结果应低于10 EU/剂。抗生素残留量采用酶联免疫法检测，应不高于50 ng/剂。铝含量不应高于0.43 mg/mL。如加硫柳汞，不应高于60 μg/mL。游离甲醛含量不应高于50 μg/mL。

（4）保存和运输　于2～8℃避光保存和运输。

乙型肝炎疫苗的生产及优化措施

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