生物制品质量检验方法简介

2023-06-24 理论教育版权反馈

【摘要】：生物制品的质量直接关系到使用者的健康，为保证生物制品的质量安全，WHO要求各国生产的制品必须由专门检定机构负责成品的质量检定，并规定检定部门要有熟练的高级技术人员、精良的设备条件，以保证检定工作的质量。因此，对这类制品应检测血型物质的含量，其含量应在规定限量范围之内。（三）效力试验生物制品的效力一方面指制品中有效成分的含量水平，另

生物制品的质量直接关系到使用者的健康，为保证生物制品的质量安全，WHO要求各国生产的制品必须由专门检定机构负责成品的质量检定，并规定检定部门要有熟练的高级技术人员、精良的设备条件，以保证检定工作的质量。未经指定检定部门发给检定合格证的制品，不准出厂使用。生物制品必须具有安全性、有效性和可接受性。

生物制品的质量检定包括两个方面，即安全性和效力检定，除此以外生物制品还应该具有可接受性。安全性检定包括毒性试验、防腐剂试验、热原质试验、安全试验、有关安全性的特殊试验（如致敏原、DNA、重金属等）等五项，效力检定包括浓度测定（含菌数或纯化抗原量）、活菌率或病毒滴度测定、动物保护率试验、免疫抗体滴度测定、稳定性试验等五项。生物制品的可接受性是指制品的生产工艺、条件，成品的药效稳定性、外观、包装、使用方法以至价格都应是可接受的。

国内新的制品在正式投产前，要按新的生物制品规程报相关国家专业检定机构（SFDA）审批。进行小量临床试验观察，并作出免疫学及相关效果评价。没有科学数据证明其安全、有效的制品，不能生产和使用。

（一）理化性质检定

通过物理化学和生物化学的方法检查生物制品中的某些有效成分和不利因素，这是保证制品安全和有效的一个重要方面。

1.物理性状的检查

（1）外观　通过特定的人工光源进行目测，对外观类型不同的制品有不同的要求。

（2）真空度及溶解时间　真空封口的冻干制品可用高频火花真空测定器检查真空度，瓶内应出现蓝紫色光。另外，取一定量冻干制品，按规程要求加适量溶剂，其溶解时间应在规定时限内。

（3）装量　各种装量规格的制品应通过容量法测试，其实际装量不得少于标示量（粘瓶量除外）。

2.蛋白质含量测定

对类毒素、血液制品、抗毒素和纯化菌苗、基因工程产品等，需要测定其蛋白质含量，检查其有效成分或蛋白质杂质是否符合规程要求。常用的测定方法包括：①凯氏定氮法；②双缩脲法；③酚试剂法（Lowry法）；④紫外吸收法。

3.纯度检查及鉴别试验

对血液制品、抗毒素和类毒素以及基因工程产品等制品，需要检查其纯度或做鉴别试验，常用区带电泳、免疫电泳、凝胶层析、超速离心等技术进行分析。

4.相对分子质量或分子大小测定

对提纯的蛋白质制品如白蛋白、丙种球蛋白或抗毒素，在必要时需测定其单体、聚合体或裂解片段的相对分子质量及分子的大小；对提纯的多糖疫苗，需测定多糖的分子大小及其相对含量。常用的测定方法包括：①凝胶层析法；②SDS-PAGE法；③超速离心分析法。

5.防腐剂含量测定

生物制品在制造过程中，为了脱毒、灭活或防止杂菌污染，常加入苯酚、甲醛、氯仿、硫柳汞等试剂作为防腐剂或灭活剂。各种防腐剂的含量都要按《中国药典》（2010年版）第三部要求控制在一定的限度以下。

（二）安全试验

为保证生物制品的安全性，在生产过程中须进行安全性的全面检查，排除可能存在的不安全因素，以保证制品用于人体时不致引起严重反应或意外事故。安全性检查包括菌毒种或主要原材料的检查、半成品的检查和成品检查三个方面。安全试验的具体内容包括以下四个方面。

1.外源性污染的检查

除无菌与纯菌试验外，还需进行以下项目的检查。

（1）野毒检查　组织培养疫苗，有可能通过培养病毒的细胞（如鸡胚细胞、地鼠肾细胞和猴肾细胞等）带入有害的潜在病毒，这种外来病毒也可在培养过程中繁殖，污染制品，故应进行野毒检查。

（2）热原质试验　血液制品、抗毒素、多糖疫苗等制品，其原材料或在制造过程中，有可能被细菌或其他物质污染并带入制品，引起机体的致热反应。因此，这些制品必须按照国内外药典的规定，以家兔试验法作为检查热原质的基准方法，对产品进行热原质检查。

（3）乙型肝炎表面抗原（HBsAg）检查　血液制品除了对原材料（血浆、胎盘）要严格进行HBsAg检查外，对成品也应进行该项检查。

2.杀菌、灭活和脱毒检查

一些死疫苗、灭活疫苗以及类毒素等制品，常用甲醛溶液或苯酚作为杀菌剂或灭活剂。这类制品的毒种多为致病性强的微生物，若未被杀死或解毒不完全，就会在使用时发生严重事故，所以需进行安全性检查。

（1）无菌试验　基本方法与检查外源性杂菌方法相同。但由于本试验的目的主要是检查有无生产菌（毒）种生长，故应采用适于本菌生长的培养基，且要先用液体培养基进行稀释和增殖再进行移种。

（2）活毒检查　活毒检查主要是检查灭活疫苗解毒是否完善，须用对原毒株敏感的动物进行试验，一般用小白鼠。如制品中残留未灭活的病毒，则注射动物后，能使动物发病或死亡。

（3）解毒试验　解毒试验主要用于检查类毒素等需要脱毒的制品，须用敏感动物进行检查。例如，检查破伤风类毒素用豚鼠试验，如脱毒不完全有游离毒素存在，可使动物出现破伤风症状并死亡。白喉类毒素可用家兔做皮肤试验，若脱毒不完全，则注射部位出现红肿、坏死。

3.残余毒力的检查

残余毒力的检查适用于活疫苗。生产这类制品的菌毒种本身是活的减毒（弱毒）株，允许有一定的轻微残余毒力存在。残余毒力与活疫苗的免疫原性有关。残余毒力过小，免疫原性低；反之，残余毒力过大，免疫原性虽好，但毒性反应大，使用不安全。残余毒力能在所接种动物的机体反应中表现出来。不同制品，其残余毒力的大小有不同的指标要求，测定和判断的方法也不同。

4.过敏性物质的检查

（1）过敏性试验（变态反应试验）采用异体蛋白为原料制成的治疗制剂（如治疗血清、代人血浆等），需检查其中过敏原的去除是否达到允许限度。一般用豚鼠进行试验。

（2）牛血含量的测定　牛血含量的测定主要用于检查组织培养疫苗（如乙型脑炎疫苗、麻疹疫苗、狂犬病疫苗），要求其含量不超过1 μg/mL。由于牛血清是一种异体蛋白，如制品中残留量偏高，多次使用能引起机体变态反应，故应进行监测。测定方法一般采用间接血细胞凝集抑制试验或反向血细胞凝集试验。

（3）血型物质的检测　白蛋白、丙种球蛋白、冻干人血浆、抗毒素等制品常含有少量的A或B血型物质，可使受试者产生高滴度的抗A、抗B抗体，O型血孕妇使用后，可能引起新生儿溶血症。因此，对这类制品应检测血型物质的含量，其含量应在规定限量范围之内。

（三）效力试验

生物制品的效力一方面指制品中有效成分的含量水平，另一方面指制品在机体中建立自动免疫或被动免疫后所引起的抗感染作用的能力。对于诊断用品，其效力则表现在诊断试验的特异性和敏感性。无效的制品，不仅没有使用价值，而且可能给防疫、治疗或诊断工作带来贻误疫情或使病情加重的后果。效力检定是十分必要的，有时还要进行人体效果观察。效力试验包括以下五个方面的内容。

1.免疫力试验

将制品对动物进行自动（或被动）免疫后，用活菌、活毒或毒素攻击，从而判定制品的保护力强弱。

（1）定量免疫　定量攻击法用豚鼠或小鼠，先以定量制品（抗原）免疫2～5周后，再以相应的定量（若干最小致死量（MLD）或最小感染量（MID））毒种或毒素攻击，观察动物的存活数或不受感染的情况，以判定制品的效力。但需事先测定一个毒种或毒素的MLD（或MID）的剂量水平，还需设立对照组，只有在对照试验成立时，才可判定试验组的检定结果。该法多用于活菌苗和类毒素的效力检定。

（2）变量免疫定量攻击法　变量免疫定量攻击法即50%有效免疫剂量（ED50、ID50）测定法。疫苗经系列稀释，制成不同的免疫剂量，分别免疫各组动物，间隔一定日期后，各免疫组均用同一剂量的毒种攻击，观察一定时间，用统计学方法计算出能使50%的动物获得保护的免疫剂量。此法多用小白鼠进行，其优点是较为敏感和简便，有不少制品（如百日咳菌苗、乙型脑炎疫苗）用此法进行效力检定。

（3）定量免疫变量攻击法　定量免疫变量攻击法即保护指数（免疫指数）测定法。动物经制品免疫后，其耐受毒种的攻击量相当于未免动物耐受量的倍数，称为保护指数。试验时，将动物分为对照组和免疫组，每组又分为若干试验组。免疫组动物先用同一剂量制品免疫，间隔一定日期后，与对照组同时以不同稀释度的毒菌或活毒攻击，观察两组动物的存活率，按LD50计算结果。

死疫苗及灭活疫苗的效力可用保护指数表示。如对照组的LD50为10个毒种，而免疫组的LD50为1000个毒种，则免疫组的耐受量为对照组的100倍，即该疫苗的保护指数为100。

（4）被动保护力测定　先从其他免疫机体（如人体）获得某制品的相应抗血清，用以注射动物，待一至数日后，用相应的毒种攻击，观察血清抗体的被动免疫所引起的保护作用。

2.活菌数和活病毒滴度测定

（1）活菌数（率）测定　卡介苗、鼠疫活菌苗、布氏菌病活菌苗、炭疽活菌苗等多以制品中抗原菌的存活数（率）表示其效力。一般先用比浊法测出制品含菌浓度，对制品进行适当稀释（估计接种后能长出1～10个菌），取一定量稀释菌液涂布接种于适宜的平皿培养基上，培养后统计菌落数，计算活菌率（%）。对于需长时间培养的细菌（如卡介菌），可改用斜面接种，以免由于培养时间过长，培养基干裂，影响细菌生长。

（2）活病毒滴度测定　活疫苗（如麻疹疫苗、流感活疫苗）多以活病毒滴度表示其效力。滴度为每毫升血清中的抗体效价。常用组织培养法或鸡胚感染法测定。

3.类毒素和抗毒素的单位数测定

（1）絮状单位（L1）数测定　能和一个单位抗毒素首先发生絮状沉淀反应的（类）毒素量称为一个絮状单位。此单位数常用以表示类毒素或毒素的效价。

（2）结合单位（BU）数测定　能与0.01单位抗毒素中和的最小类毒素量称为一个结合单位。此单位数常用以表示破伤风类毒素的效价，用中和法通过小鼠测定。

（3）抗毒素单位数测定　目前国际上都用“国际单位”（IU）代表抗毒素的效价。它的含义是：当与一个L+量（致死限量）的毒素作用后，再注射动物（小白鼠、豚鼠或家兔），仍能使该动物在一定时间内（96 h左右）死亡或呈现一定反应所需要的最小抗毒素量，即为一个抗毒素国际单位。

4.血清学试验

血清学试验主要用来测定抗体水平或抗原活性。预防制品接种机体后，可产生相应抗体，并可保持较长时间。接种后抗体形成的水平也是反映制品质量的一个重要方面。基于抗原和抗体的相互作用，常用血清学方法检查抗体或抗原活性，并多在体外进行试验，包括沉淀试验、凝集试验、间接血凝试验、间接血凝抑制试验、反向血凝试验、补体结合试验及中和试验等。

5.其他有关效力的检定和评价

（1）鉴别试验（也称同质性（identity）试验）一般采用已知特异血清（国家检定机构发给的标准血清或参考血清）和适宜方法对制品进行特异性鉴别。

（2）稳定性试验　制品的质量水平不仅表现为出厂时效力检定结果，而且表现为效力稳定性。因而需对产品进行稳定性测定和考察。一般方法是将制品在不同温度（2～10℃，25℃，37℃）下放置，观察不同时间（1周，2周，3周，…；1月，2月，3月，…）的效力下降情况。

（3）人体效果观察　有些用于人体的制品，特别是新制品，仅有实验室检定结果是不够的，必须进行人体效果观察，以考核和证实制品的实际质量。观察方法常有以下几种。

①人体皮肤反应观察。一般在接种制品一定时间后（1个月以上），再于皮内注射反应原，观察24～48 h的局部反应，以出现红肿、浸润或硬结反应为阳性，表示接种成功。阳性率的高低反映制品的免疫效果，也是细胞免疫功能的表现。

②血清学效果观察。将制品接种人体后，定期采血检测抗体水平，并可连续观察抗体的动态变化，以评价制品的免疫效果和持久性。它反映接种后的体液免疫状况。

③流行病学效果观察。在传染病流行期的疫区现场，考核制品接种后的流行病学效果。这是评价制品质量的最可靠的方法。但观察方案的设计必须周密，接种和检查的方法必须正确，观察组和对照组的统计结果说明问题，才能得出满意的结论。

（4）临床疗效观察　治疗用制品的效力必须通过临床使用才能确定。观察时，必须制订妥善计划和疗效指标，选择一定例数适应证患者，并取得临床诊断和检验的准确结果，才能获得正确的疗效评价。

生物制品质量检验方法简介

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