抗HBsAg单克隆抗体生产优化方案

2023-06-24 理论教育版权反馈

【摘要】：图1-9-9抗HBsAg的单克隆抗体生产工艺路线二、生产工艺过程（一）材料准备1.培养基大鼠骨髓瘤IR983F细胞系培养基：改良的DMEM培养基，还需要10%灭活小牛血清、1%非必需氨基酸、0.1 mol/L丙酮酸钠、1%谷氨酰胺及50 mg/mL庆大霉素。（三）杂交瘤细胞筛选筛选产生抗HBsAg单克隆抗体的杂交瘤细胞的方法是用AUSAB酶联免疫试剂盒测定表达抗体的细胞，即将包被了人HBsAg的聚苯乙烯珠于待测杂交瘤培养上清液培育。

一、确定生产技术、生产原料和工艺路线

（1）确定生产技术——细胞工程：采用细胞融合技术制备抗HBsAg单克隆抗体。

（2）确定生产原料：HBsAg免疫后的Lou/c大鼠淋巴细胞与Lou/c大鼠骨髓瘤的IR983F细胞系。

（3）确定生产工艺路线，如图1-9-9所示。

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图1-9-9　抗HBsAg的单克隆抗体生产工艺路线（细胞工程）

二、生产工艺过程

（一）材料准备

1.培养基

（1）大鼠骨髓瘤IR983F细胞系培养基：改良的DMEM培养基（将Eagle培养基中15种氨基酸浓度增加1倍，8种维生素浓度增加3倍而成），还需要10%灭活小牛血清、1%非必需氨基酸、0.1 mol/L丙酮酸钠、1%谷氨酰胺及50 mg/mL庆大霉素。

（2）杂交瘤细胞筛选系统培养基：用含有HAT的DMEM培养基。

2.饲养细胞制备

在组织培养中，单个或少数分散的细胞不易生长繁殖，若加入其他活细胞，则可促进这些细胞生长繁殖，所加入的这种细胞为饲养细胞。在McAb制备的过程中，如杂交瘤细胞的筛选、克隆化和扩大培养等许多环节都需要添加饲养细胞。

在细胞融合前2～3 d，取健康大鼠处死，向腹腔内注入10 mL DMEM培养液，使细胞悬浮，在腹壁吸出全部细胞悬液，离心后用pH7.4、0.1 mol/L的磷酸缓冲液洗涤，收集细胞，用含10%小牛血清、100 U/mL青霉素和链霉素及HAT的DMEM培养液制成2×105个/mL细胞悬液，在96孔板上每孔加0.1 mL悬液，然后置于37℃的CO2培养箱中温育，备用。

3.亲本细胞准备

（1）骨髓瘤细胞　取Lou/c大鼠骨髓瘤IR983F细胞，用常规方法制成细胞悬液，按1.5×105个/mL细胞的接种量接种于DMEM培养液中，于37℃的CO2培养箱中培养至对数生长期，经常规消化分散法用DMEM培养液制成细胞悬液。

（2）免疫大鼠脾淋巴细胞　取HBsAg，用pH7.4、0.1 mol/L的磷酸缓冲液溶解并稀释成20 μg/mL的溶液，加等体积弗氏完全佐剂充分乳化后，取2 mL注入Lou/c大鼠腹腔，两周后进行第二次免疫，3个月后于融合前3～4 d进行加强免疫，3次免疫的剂量和注射途径均相同（第三次免疫时不加弗氏佐剂），在细胞融合前处死大鼠，取出脾脏，用磷酸缓冲液洗去血液，切成1 mm3小块，再用磷酸缓冲液洗涤至澄清后，加入组织块5～6倍体积的0.25%胰蛋白酶溶液于37℃保温消化，至组织块松软为止。倾去胰蛋白酶溶液，经磷酸缓冲液洗涤后，加入少量磷酸缓冲液分散大部分组织块为细胞，用两层无菌纱布过滤，离心收集细胞并用磷酸缓冲液洗涤，然后用无血清的DMEM培养液稀释制成细胞悬液。

（二）细胞融合

取104个IR983F细胞与108个免疫大鼠脾淋巴细胞，于50 mL离心管中混匀，4℃离心去上清液，并使沉淀的细胞松动。于37℃水浴中保温，滴加0.8 mL50%PEG4000，轻轻搅动后滴加20 mL DMEM培养液，离心去上清液，再用含20%小牛血清的DMEM培养液稀释至50 mL，制成细胞悬液。取25 mL悬液加至两块含饲养细胞的24孔培养板中，每孔加0.5 mL；余下25 mL悬液再用含20%小牛血清的DMEM培养液稀释至50 mL，依上法再接种两块24孔培养板；以此类推，每次悬液可接种8～10块24孔培养板，按IR983F计，每孔接种细胞数约为105个。然后于37℃的CO2培养箱中培养2～4 d，每天从各孔中吸去1 mL原培养液，替换含20%小牛血清及HAT的DMEM培养液，继续培养至第5～6 d可见小克隆，至第9～10 d可见大克隆，中途不换HT培养液。若培养液出现淡黄色，可取出一部分培养液进行抗体检测。培养10 d后改换含HT的培养液，继续培养两周后改用常规DMEM培养液培养。

（三）杂交瘤细胞筛选

筛选产生抗HBsAg单克隆抗体的杂交瘤细胞的方法是用AUSAB酶联免疫试剂盒测定表达抗体的细胞，即将包被了人HBsAg的聚苯乙烯珠于待测杂交瘤培养上清液培育。用磷酸缓冲液洗涤后，加入用生物素偶联的HBsAg培育后洗涤，再加过氧化物酶标记的亲和素培育，最后用邻苯二胺（UPD）显色，经酶标仪定量测定，以确定产生抗HBsAg单克隆抗体（见图1-9-10）。

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图1-9-10　杂交瘤细胞筛选（酶联免疫法）

经检测确定为产生抗HBsAg单克隆抗体的阳性孔细胞需进行克隆和再克隆，并经全面鉴定与分析后，才获得产生抗HBsAg单克隆抗体的杂交瘤克隆系。其过程如下：将阳性孔中的培养细胞经常规消化分散法制成细胞悬液，用含20%小牛血清的DMEM培养液依次稀释成50个/mL细胞悬液，然后在已有饲养细胞的96孔培养板的第1～3行中接种细胞，每孔接种细胞数平均为5个；余下细胞悬液再稀释，在第4～6行孔中每孔接种细胞数平均为1个；余下细胞悬液再稀释，在7～8行孔中每孔接种细胞数平均为0.2个，然后置于37℃的CO2培养箱中，通入含5%CO2的无菌空气培养至第5～6 d，经镜检记下单克隆孔，补加0.1 mL培养液。在生长良好的情况下，第1～3行难有单克隆，第4～6行偶有单克隆，第7～8行多为单克隆。培养至9～10 d后有部分孔中培养上清液变淡黄色，表明可能已有抗体产生。然后将阳性孔内细胞分散接种至其他孔板中培养，并在原板各孔中替换培养液，以防污染及细胞死亡。当新的孔板中细胞生长良好时，即进行消化分散转移至小方瓶中扩大培养，同时将细胞保存。所获的阳性培养物需反复再克隆和全面鉴定，直至确认为止。

（四）抗HBsAg单克隆抗体的生产

抗HBsAg单克隆抗体可采用人工生物反应器培养杂交瘤细胞进行生产，也可通过诱发实体瘤及腹水瘤进行生产。腹水瘤生产过程如下：向健康的Lou/c大鼠腹腔注射1 mL降植烷，饲养1～9周后，向大鼠腹腔接种5×106个杂交瘤细胞，饲养9～11 d后即可明显产生腹水，待腹水量达到最大限度而大鼠濒于死亡时，处死并抽取腹水，一般可得50 mL左右。或者不处死动物，每1～3 d抽取1次腹水，一般可抽取10次以上，从而获得更多单克隆抗体。

（五）抗HBsAg单克隆抗体的分离纯化

将抗HBsAg单克隆抗体的亲和吸附剂——固定化抗大鼠κ轻链的Sepharose 4B亲和吸附剂装柱。用5倍柱床体积的pH 7.4、0.1 mol/L磷酸缓冲液洗涤和平衡柱床，然后将100 mL含抗HBsAg单克隆抗体的腹水用生理盐水稀释5倍后上柱，再用pH 7.4、0.1 mol/L磷酸缓冲液洗涤柱，同时测定A280，待出现第一个杂蛋白峰后，改用含2.5 mol/L NaCl的上述磷酸缓冲液洗涤，除去非特异性吸附的杂蛋白，然后用pH 2.8的甘氨酸-HCl缓冲液洗脱，同时分部收集洗脱液，用pH 8.0、0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液中和（至pH7.0），经超滤、浓缩及冻干后即得抗HBsAg单克隆抗体。

抗HBsAg单克隆抗体生产优化方案

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