制备HBsAg抗体的单克隆抗体生产

2023-06-24 理论教育版权反馈

【摘要】：抗乙肝表面抗原单克隆抗体是专一性识别HBsAg的单一抗体，能与HBsAg产生免疫反应，临床上用于检测乙肝病毒的感染及生产预防乙肝的免疫制剂。

一、生产前准备

（一）查找资料，了解抗HBsAg单克隆抗体生产的基本知识

乙型肝炎是一种世界范围的流行性传染病，目前还没有有效的治疗手段，因此预防是防治乙型肝炎的重点。血源性抗乙肝表面抗原（HBsAg）的抗体可用于乙型肝炎的被动免疫，防止乙肝的母婴垂直传播。但是，血源性抗体的来源有限且具有潜在的传染性，其应用受到限制。开发重组人源性抗HBsAg抗体，可以实现抗体的工业化大规模生产，而且使用安全，可以弥补血源性抗体所存在的缺陷，进而取代血源性抗体，因此具有良好的社会效益和经济效益。

抗乙肝表面抗原单克隆抗体是专一性识别HBsAg的单一抗体，能与HBsAg产生免疫反应，临床上用于检测乙肝病毒的感染及生产预防乙肝的免疫制剂。单链抗体（scFv）是由抗体重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）经连接肽拼接后形成的小分子抗体。这种新的抗体片段保持原有抗体结合位点的特异性及亲和力，并有相对分子质量小、穿透力强、体内半衰期短与免疫原性低等特点，且易于与效应分子相连，是构建免疫毒素和双特异抗体的理想元件。因此，本任务是基因工程抗体的获得及在大肠杆菌中的表达实例。

抗体的生产包括胞内包含体表达和胞外分泌两种形式。胞内包含体表达是指抗体在大肠杆菌细胞质中形成一种不溶无活性包含体，需要破碎细胞将抗体释放出来。其优点在于防止宿主酶类对抗体的降解，抗体产量高但和抗原结合活性较低。胞外分泌时细胞表达和分泌完整功能抗体，此时分泌肽可将抗体片段引向胞周质，抗体在此折叠，形成适当二硫键、异源二聚体联系，而可变区内二硫键对于稳定Fab、Fv和scFv及其早期折叠有重要意义。

（二）确定生产技术、生产原料和工艺路线

（1）确定生产技术——基因工程：噬菌体抗体库技术将人源性抗HBsAg单链抗体在大肠杆菌中表达及纯化、复性。

（2）确定生产原料：乙肝疫苗免疫志愿者的外周血淋巴细胞。

（3）确定生产工艺路线，如图1-9-8所示。

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图1-9-8　抗HBsAg的单克隆抗体生产工艺路线（基因工程）

二、生产工艺过程

（一）材料准备

（1）质粒和菌株：表达载体pQE40及宿主菌M15［pREP4］，构建含有抗HBsAg Fab片段抗体基因的质粒pComb3H-Fab。

（2）主要试剂：各种工具酶、鼠RGS-HisTM单克隆抗体、质粒提取和胶回收试剂盒、乙型肝炎表面抗体试剂盒、His-TrapTM镍螯合层析柱。

PCR引物的序列分别为

VH 5'引物　5'-TTGGATCCCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCT-3'

VH3'引物　5'-CCGCCACTGCCCCCTCCACCGCTCCCTCCGCCACCTGAGGAGACGGTGACCAGGGT-3'

Vκ5'引物　5'-GGAGCGGTGGAGGGGGCAGTGGCGGGGGAGGTAGCGACATTGTGTTGACCCAGTCT-3'

Vκ3'引物　5'-GCAAGCTTTTATCGATTGATTTCCACCTTGGT-3'

其中VH3'引物和Vκ5'引物含有连接肽序列（Gly4Ser）3（能使重、轻链可变区自由折叠、使抗原结合位点处于适当的构型，并尽可能减少蛋白酶攻击和防止单链抗体聚集的连接肽）。

（二）含人抗乙型肝炎表面抗原（HBsAg）抗体的Fab片段的获得及其质粒构建

利用噬菌体呈现技术将Fab段表达在噬菌体表面，克隆所需抗体，改善抗体的性能。其过程如下：从一经乙肝疫苗免疫的志愿者的外周血分离淋巴细胞，提取RNA，反转录合成cDNA，PCR扩增重链Fd和κ基因（轻链只有两种类型的序列，且一个抗体分子中只有一种轻链，故非κ型即λ型），依次将PCR产物克隆进载体pComb3H相应的位点，构建成一实际库容量为1.8×105的噬菌体呈现文库，通过特异的富集筛选（panning，其基本过程是，抗原固相化后，对噬菌粒群吸附、洗涤和洗脱后再感染扩增，与辅助噬菌体超感染获得大容量次级文库，再反复与抗原吸附，经几轮淘汰筛选后，淘汰了非目的克隆，且使目的克隆大量地扩增）获得与HBsAg有较高亲和力的Fab抗体。经测序鉴定后，该人源性HBsAg特异性Fab片段在大肠杆菌中获得分泌表达。

（三）scFv表达质粒的构建

为克服Fab抗体分泌表达量较低的缺点，将Fab抗体的轻、重链可变区连接起来构建成单链抗体。但由于单链抗体无恒定区，对后期进行的ELISA检测造成困难，因此可设计为先在目的基因的N末端融合RGS-6×His标签，以便纯化和检测。

以含抗HBsAg Fab抗体基因的pComb3H-Fab质粒为模板，分别以H链和κ链引物进行PCR，扩增出H链和κ链可变区，再以回收的VH和Vκ基因为模板，用H链5'引物和κ链3'引物进行PCR，使H和κ连接成单链。PCR回收产物及表达载体pQE40分别用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切后连接，导入感受态菌株JM109，筛选重组质粒pQE-scFv，然后以Sanger双脱氧法测定目的基因序列。

（四）单链抗体在大肠杆菌中的表达

单链抗体相对分子质量小，只有两对链内二硫键，易于以包含体的形式获得高效表达。

测序正确的重组质粒转化表达宿主菌M15［pREP4］，挑选单克隆接种于2 mL含Amp 100 mg/L、Kan25 mg/L的LB培养基，37℃振荡培养过夜，次日按5%接种量转入含同样抗生素的LB培养基中，37℃剧烈振摇约1 h至A600为0.5～0.7。此时加入IPTG至终浓度为1 mmol/L，继续培养4～5 h，诱导包含体高效表达，离心收集菌体，SDSPAGE及Western-blot分析结果。

（五）目的蛋白的纯化及体外复性

表达菌体以TE重悬，超声破碎，收集沉淀；先后用含1%TritonX-100的TE和含2 mol/L尿素的TE洗涤各1次，再用含8 mol/L尿素的变性液溶解。离心收集包含体裂解上清液，上样至His-TrapTM镍螯合层析柱，收集目的峰成分，透析复性。透析复性时，将透析液中的尿素浓度从4 mol/L逐步降低至10 mmol/L，则获得的产物比活力最强，其亲和常数在108mol/L水平。

（六）复性蛋白活性测定

采用间接ELISA法测定。在包被HBsAg的酶标板内加入复性蛋白液100μL，37℃温育1 h后加入鼠RGS-HisTM抗体，继续温育1 h，洗涤后加入HRP（辣根过氧化物酶）标记的羊抗鼠IgG，温育40 min后用TMB（四甲基联苯胺，为辣根过氧化物酶常用显色底物）显色；用酶标仪在450 nm、630 nm波长处测定吸光度。

（七）蛋白质定量

采用Bradford法，根据蛋白质所在溶剂的不同，以BSA（牛血清白蛋白）作不同的标准曲线，同时在每次测定时，以已知浓度的BSA作为质控物。

制备HBsAg抗体的单克隆抗体生产

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