抗体药物生产技术优化策略

2023-06-24 理论教育版权反馈

【摘要】：图1-9-3多克隆抗体生产工艺流程在多克隆抗体的生产过程中，应注意以下环节。免疫剂量应依照动物的种类、免疫周期以及所要求的抗体特性等不同而定。（二）单克隆抗体的生产工艺单克隆抗体生产多采用杂交瘤技术，它是将抗体产生细胞与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞相融合，通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为单一的单克隆细胞系而产生的。在一定范围内，抗体的效价随注射剂量的增加而增高。抗体的特异性高，其识别能力就强。

（一）多克隆抗体的生产工艺

多克隆抗体的生产多采用传统的从动物的抗血清提取的方法。其生产工艺流程如图1-9-3所示。

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图1-9-3　多克隆抗体生产工艺流程

在多克隆抗体的生产过程中，应注意以下环节。

1.免疫动物

（1）选择动物种类：供免疫的动物主要是哺乳类和禽类，常选择家兔、绵羊、马、小鼠等。

（2）选择动物属性：通常选用适龄健康雄性，雌性特别是妊娠动物不适合生产免疫抗体。

（3）数量：由于对免疫应答的个体差异，应同时选用数只动物进行免疫。

2.抗原准备

（1）抗原种类：有蛋白质抗原、类脂抗原、多糖类抗原和核酸抗原等，不同抗原的免疫原性强弱均不相同。为了获得较好的抗血清，最好选用蛋白质抗原。

（2）佐剂：对可溶性抗原而言，常采用加佐剂的方法以刺激机体产生较强的免疫应答。加佐剂的注射剂量比不加佐剂的要小。

将抗原与佐剂混合的过程称为乳化。乳化的方法很多，可采用研钵乳化，可直接在振荡器上乳化，也可用组织捣碎器乳化。乳化好的标志是取一滴乳化剂滴入水中后呈球形而不分散。如出现平展扩散，则为未乳化好。乳化过的物质放置一段时间后不能出现油水分层现象。

目前常用的佐剂有氢氧化铝胶、明胶、弗氏佐剂、脂质体、液状石蜡、植物油、矿物油等，也有采用结核杆菌、分枝杆菌、白喉杆菌以及细小棒状杆菌的。

3.免疫过程

（1）免疫途径与剂量　免疫途径包括皮下注射、皮内注射、肌肉注射、静脉注射、腹腔注射、淋巴结内注射。免疫剂量应依照动物的种类、免疫周期以及所要求的抗体特性等不同而定。若免疫剂量过低，则不能引起足够强度的免疫刺激；若免疫剂量过高，又有可能引起免疫耐受。在一定范围内，抗体的效价随注射剂量的增加而增高。免疫剂量中一般静脉注射剂量大于皮下注射剂量，而皮下注射又比掌内和跖内皮下注射时剂量大。加强剂量为首次剂量的1/5～2/5。

（2）免疫周期　带佐剂的皮内、皮下注射，一般间隔2～4周免疫一次。不带佐剂的皮下或肌肉注射，间隔时间为1～2周。肌肉或静脉注射，一般间隔5 d左右。也可以把各种注射途径联合起来应用，最终以达到效价要求为目的。一般免疫周期长的，可少量多次；免疫周期短的，应大量少次。

4.抗体的鉴定

（1）效价鉴定　不管是用于诊断还是治疗，生产抗体时都希望得到较高效价。鉴定效价的方法很多，包括试管凝集反应、琼脂扩散试验、酶联免疫吸附（ELISA）试验。

（2）特异性鉴定　抗体特异性是指对相应抗原或近似抗原物质的识别能力。抗体的特异性高，其识别能力就强。特异性通常以交叉反应率来表示。如一抗血清与其他抗原物质的交叉反应率近似为零，即该血清的特异性较好。

（3）亲和力　抗体的亲和力是指抗体和抗原结合的牢固程度，常用亲和常数K表示。通常K的范围在108～1010/mol，也有多达1014/mol。

5.抗血清的保存

抗血清收获后，加0.01%叠氮化钠或0.01%硫柳汞溶液防腐，也可加入等量中性甘油，分装后于-20℃以下保存，注意避免反复冻融。也可将抗血清冷冻干燥后保存。

（二）单克隆抗体的生产工艺

单克隆抗体生产多采用杂交瘤技术，它是将抗体产生细胞与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞相融合，通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为单一的单克隆细胞系而产生的。

单克隆抗体生产的工艺流程如图1-9-4所示，可分为五个环节：

①亲本细胞制备；②细胞融合；③杂交瘤细胞的选育；④杂交瘤细胞的培养；⑤单克隆抗体的分离纯化。其工艺要点如下。

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图1-9-4　单克隆抗体生产工艺流程

1.免疫动物

免疫动物品系与骨髓瘤细胞相同，杂交瘤才稳定。常用的骨髓瘤品系为BALB/C小鼠和Lou大鼠。

免疫方法有体内免疫和体外免疫两种方式。前者由静脉直接注入Ag，可追加免疫，在B淋巴细胞受到可靠的最大限度刺激后，增殖率最高时收集。适用于免疫原性强、抗原量较多的情况。而后者适用于不能采用体内免疫法的情况，如Ag的免疫原性弱且能引起免疫抑制时。优点：所需Ag量少、免疫期短、干扰因素少。缺点：融合后产生的杂交瘤不够稳定。

2.亲本细胞的制备

（1）制备B淋巴细胞。

杀死发生免疫反应的动物（如4～8周龄、体外免疫的小鼠），取出脾脏，洗净、研碎，制成单细胞悬液。再加入适当Ag使其浓度达0.5～5 μg/mL，在5%CO2下，37℃培养4～5 d。分离B淋巴细胞，制成悬液。

（2）制备骨髓瘤细胞。

选用次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷型（HGPRT-）骨髓瘤细胞，还应具备融合率高、自身不分泌抗体，所产生的杂交瘤细胞分泌抗体的能力强且长期稳定等特点。目前常用较为理想的骨髓瘤细胞系有SP2/0、P3.653等。

骨髓瘤细胞的培养采用RPMI1640或DMEM培养基等一般培养液即可，小牛血清的浓度一般在10%～20%。细胞浓度最大不得超过106个/mL，当细胞处于对数生长中期时可传代培养，避免细胞密度过大。传代时定期用8-氮鸟嘌呤进行处理，使生存的细胞对HAT（次黄嘌呤（hypoxanthine）、氨基蝶呤（aminopterin）、胸腺嘧啶（thymidine））呈均一的敏感性。

3.细胞融合

适量混合：脾细胞1×108，骨髓瘤细胞1×107～5×107。

PEG（相对分子质量为4000，40%～50%）诱导融合，2 min以内。

PEG相对分子质量和浓度越大，融合率越高，但毒性越大。为提高融合率，可加入DMSO以提高细胞接触的紧密性。

此外还有电融合法、激光法等。

4.杂交瘤细胞的选择性培养

（1）融合后的细胞转入选择性培养基中以获得目的细胞。

融合细胞悬浮于HAT培养基中，加入96孔板内，2～3 d换液一次，每次吸去1/2～2/3的培养液，再加入等量新鲜培养液。

采用HAT培养基是由于氨基蝶呤能阻断DNA合成的主要途径，瘤-瘤融合细胞和瘤细胞因HGPRT-，不能利用次黄嘌呤合成DNA而死亡。脾-脾融合细胞培养几天后也会死亡，而杂交瘤细胞则由于脾细胞提供HGPRT，以及补充的嘧啶而可存活。

（2）7～14 d改用HT培养液。

（3）14 d后用普通的RPMI1640或DMEM完全培养液。

杂交瘤数量少，不易存活，故常加入饲养细胞（feeder cell），分泌生长刺激因子，满足新生杂交瘤细胞对细胞密度的要求。例如，小鼠腹腔巨噬细胞、脾细胞、胸腺细胞等。

5.杂交瘤细胞的筛选

由于上述选择性培养得到存活的杂交瘤细胞中具备产生特定Ab能力的细胞比例很小，所以要进行每孔培养上清液的Ab活性筛选工作，以选择出阳性克隆，然后进行克隆化培养。为了尽快筛选出产抗体的阳性克隆，筛选方法应微量、快速、特异、敏感、简便，并能一次性检验大批标本，可选用免疫酶技术、放射免疫技术、免疫荧光技术。

6.杂交瘤细胞克隆化与培养

筛选出的阳性克隆可能含有不分泌Ab的细胞或有多株分泌Ab的细胞，刚融合的细胞不稳定，应尽早进行克隆化，要经过三次克隆化才能达到100%的阳性。方法如下。

（1）有限稀释法：把杂交瘤细胞悬液稀释至每孔1个细胞，第一次克隆化时用HT培养液，以后的可用RPMI 1640并加入饲养细胞。

（2）软琼脂法：在培养液中加入0.5%左右的琼脂糖凝胶，细胞分裂后形成小球样团块，由于培养基是半固体的，可用毛细管将小球吸出，团块经打碎后，移入96孔板继续培养。

7.杂交瘤细胞与Ab性状的检定

（1）染色体检定　正常鼠脾细胞染色体数是40，小鼠骨髓瘤细胞染色体数大于40（54～64，62～68）。染色体数目较多且较集中的杂交瘤细胞能分泌高效价的Ab。

（2）纯度检定　采用SDS-PAGE电泳法。

8.单克隆抗体的大量生产方法

（1）腹水诱导法　小鼠腹腔注射0.5 mL降植烷（或液状石蜡）致敏，8～10 d后腹腔接种1×106个杂交瘤细胞，待2～4 d后腹部胀大，生成腹水后（1～2周）再抽取，隔日采集3～5 mL至死（也可最大腹水时处死，一次性抽取）。离心去细胞沉淀，取上清液冻存，可获得5～20 mg/mL的抗体。

（2）体外培养　筛选鉴定后的杂交瘤细胞体外扩增培养可获得10 μg/mL的抗体。体外培养法多采用RPMI1640培养液，添加10%～20%胎牛或小牛血清。

9.单克隆抗体的分离纯化

由于单克隆抗体Ig的类和亚类的不同，纯化的方法也不同。另外，应根据用途不同，选择不同的纯化方法。动物体内诱生法生产的单克隆抗体的具体纯化方法及一般过程如下。

（1）澄清和沉淀处理。

由于小鼠腹水中含有红细胞、细胞碎块、纤维蛋白凝块及脂质等，应首先1000g离心5 min，去除沉淀物，再20000g高速离心30 min，去除残留的小颗粒物质；用0.2 μm微孔滤膜过滤，除掉污染的细菌、支原体和脂质；用硫酸铵饱和溶液沉淀抗体，50%饱和硫酸铵溶液能回收90%以上的单克隆抗体。

（2）分离。

根据用途不同，可选用不同的方法，主要分离方法有凝胶过滤、阴离子交换层析、亲和层析等。

①凝胶过滤　凝胶过滤用于IgG和IgM类单克隆抗体的分离纯化。常用Sephadex G-200作分离介质，可收集到3个峰，最高峰为IgM，另外两个峰为IgG，抗体回收率达50%～80%，能去除污染的微量杂蛋白，抗体纯度可达95%以上。

②阴离子交换层析　阴离子交换层析用于IgG类单克隆抗体的分离纯化。在pH为7.4的条件下，IgG1和IgG2能结合在DEAE填料上。在pH为5.5的条件下，把杂交瘤细胞培养的上清液加到琼脂糖柱上时，所有的抗体都能结合到柱上，而55%的杂蛋白可被洗脱掉，再用不同离子强度的洗脱剂洗下。在最适离子强度及pH条件下，以离子交换层析分离单克隆抗体可以纯化25～100倍。

③亲和层析　亲和层析也称亲和色谱，是专门用于纯化生物大分子的色谱分离技术，它是基于固定相的配基与它的互补结合体（配体）生物分子间的特殊生物亲和能力来进行相互分离，使目标产物得以纯化的液相层析方法。配基与配体的结合方式为立体构象结合，因而具有空间位阻效应，并且它们的结合具有高度特异性和亲和性，如酶与底物、抗原与抗体、激素与受体等。

亲和层析的操作大致可分为三步（见图1-9-5）。

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图1-9-5　亲和层析基本原理示意图

a.配基固定化：选择合适的配基（如Ag）与不溶性的支撑载体偶联，或共价结合成具有特异亲和性的介质。

b.特异性吸附样品：亲和层析介质选择性吸附Ab或其他生物活性物质，杂质与层析介质间没有亲和作用，故不能被吸附而被洗涤除去。

c.样品解吸：选择适宜的条件使被吸附的亲和介质上的Ab或其他生物活性物质解吸下柱。抗体的亲和层析多用蛋白A，它收获的抗体纯度很高，适用于IgG类单克隆抗体的纯化。

（三）基因工程抗体生产工艺

基因工程抗体生产是利用基因工程方法（如噬菌体抗体库技术）获得目的抗体基因的阳性克隆后，再根据终产物的目标选用原核细胞、真核细胞、转基因植物和动物等不同方式进行表达。

1.噬菌体抗体库技术

在免疫系统中，B淋巴细胞携带编码抗体的基因，能表达并分泌抗体到细胞外，识别抗原。噬菌体类似于B淋巴细胞，也可以用于表达抗体基因。通过将抗体片段表达并呈现在丝状噬菌体表面，可以快速建立抗体文库，筛选具有高度亲和力的抗体，使基因工程抗体在大肠杆菌等系统中的表达得以迅速发展。

下面以基因工程人单链抗体（scFv）的生产为例，介绍噬菌体抗体库技术，其主要流程如图1-9-6所示，具体过程如下：①淋巴细胞的分离纯化；②总细胞RNA的提取和经反转录PCR合成cDNA；③PCR扩增抗体可变区基因及单链抗体（scFv）基因；④连接肽连接片段的制备；⑤人单链Fv（scFv）片段的组装；⑥scFv单链噬菌体抗体库的构建；⑦单链噬菌体抗体库的富集筛选。其中scFv构建过程如图1-9-7所示。

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