肌苷酸的生产实训：直接发酵法生产工艺优化

2023-06-24 理论教育版权反馈

【摘要】：最初，用棒状杆菌发酵制得肌苷酸，再以化学法加压脱掉磷酸得到肌苷，其工艺复杂，产量低，成本高。图1-8-5直接发酵法生产肌苷的工艺路线三、实训器材和试剂1.器材冰箱、恒温培养箱、摇床、发酵罐、灭菌锅等。灭菌前pH为7，用200 mL三角瓶装50 mL培养基，115℃灭菌15 min。

一、实训目标

（1）掌握发酵法生产肌苷的基本原理、方法和基本操作技能。

（2）掌握树脂吸附法在肌苷药物提取和精制方面的应用。

二、实训原理

肌苷是由次黄嘌呤与核糖结合而成的核酸类化合物，又称次黄嘌呤核苷。肌苷为白色结晶性粉末，溶于水，不溶于乙醇、氯仿，在中性、碱性溶液中比较稳定，在酸性溶液中不稳定，易分解成次黄嘌呤和核糖。

最初，用棒状杆菌发酵制得肌苷酸，再以化学法加压脱掉磷酸得到肌苷，其工艺复杂，产量低，成本高。现多采用直接发酵法生产。

直接发酵法生产肌苷的工艺路线如图1-8-5所示。

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图1-8-5　直接发酵法生产肌苷的工艺路线

三、实训器材和试剂

1.器材

冰箱、恒温培养箱、摇床、发酵罐、灭菌锅等。

2.试剂

葡萄糖、蛋白胨、酵母浸膏、牛肉浸膏、琼脂、玉米浆、尿素、氯化钠等。

四、实训方法和步骤

（1）菌株选育：将变异芽孢杆菌7171-9-1移接到斜面培养基上，30～32℃培养48 h。在4℃冰箱中菌种可保存一个月。斜面培养基成分为葡萄糖1%、蛋白胨0.4%、酵母浸膏0.7%、牛肉浸膏1.4%、琼脂2%，在pH7、120℃灭菌20 min。

（2）种子培养。

一级种子：培养基成分为葡萄糖2%、蛋白胨1%、酵母浸膏1%、玉米浆0.5%、尿素0.5%、氯化钠0.25%。灭菌前pH为7，用200 mL三角瓶装50 mL培养基，115℃灭菌15 min。三角瓶中接入白金耳环菌苔，放置在往复式摇床上，振荡频率为100次/min，（32±1）℃培养18 h。

二级种子：培养基同一级种子，放大为1 L三角瓶，定容体积为500 mL，接种量为3%，（32±1）℃培养12～15 h，振荡频率为100次/min，生长指标A650=0.78，pH为6.4～6.6。

（3）发酵。

用5 L不锈钢标准发酵罐，定容体积为3.5 L。培养基成分为淀粉水解糖10%、干酵母水解液1.5%、豆饼水解液0.5%、硫酸镁0.1%、氯化钾0.2%、磷酸氢二钠0.5%、尿素0.4%、硫酸铵1.5%、有机硅油（消泡剂）0.05%。pH为7，接种量为0.9%，（32±1）℃培养93 h，搅拌速度为320 r/min，通气量为2 L/（L·min）。

用25 L发酵罐，定容体积为15 L。培养基成分为淀粉水解糖10%、干酵母水解液1.5%、豆饼水解液0.5%、硫酸铵1.5%、硫酸镁0.1%、磷酸氢二钠0.5%、氯化钾0.2%、碳酸钙1%、有机硅油小于0.3%。pH为7，接种量为7%，（32±1）℃培养75 h，搅拌速度为230 r/min，通气量为4 L/（L·min）。

扩大发酵进入50 L发酵罐，培养基同上，接种量为2.5%，（32±1）℃培养83 h。

（4）提取、洗脱、吸附：取发酵液2～3 L，调节pH为2.5～3，连同菌体通过两个串联的100 g 732H+树脂柱吸附。再用相当树脂总体积3倍的pH为3的水洗1次，然后把两个柱分开，用pH为3的水把肌苷从柱上洗脱下来。再经769活性炭柱吸附后，先用2～3倍体积的水洗涤，后用70～80℃水洗，70～80℃1 mol/L氢氧化钠溶液浸泡30 min，最后用0.01 mol/L氢氧化钠溶液洗脱肌苷，收集洗脱液，真空浓缩。pH11或6下放置，析出结晶，过滤，得肌苷粗品。

（5）精制：取粗品配成5%～10%溶液，加热溶解，加入少量活性炭作为助滤剂抽滤，放置冷却，得白色针状晶体，过滤，用少量水洗涤1次，80℃烘干，得肌苷成品。

五、知识和技能探究

温度对肌苷提取有何影响？

肌苷酸的生产实训：直接发酵法生产工艺优化

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