生产三磷酸腺苷的方法与流程优化

2023-06-24 理论教育版权反馈

【摘要】：pH5、90℃加热70 h，可完全水解为腺苷。图1-8-3三磷酸腺苷的生产工艺路线二、生产工艺过程兔肉松的制备：将兔体冰浴降温，迅速拆去骨，绞碎，加入兔肌肉质量3～4倍的冷95%乙醇，搅拌30 min，过滤，压榨，制成肉糜。

一、生产前准备

（一）查找资料，了解腺嘌呤核苷三磷酸的基本知识

腺嘌呤核苷三磷酸简称腺三磷（ATP），又称三磷酸腺苷。核苷三磷酸是一类具有高能键的化合物，在生物体内起着很重要的作用，其中最重要的是ATP，药用ATP是其二钠盐，此外还有胞嘧啶核苷三磷酸和鸟嘌呤核苷三磷酸等。

带3个结晶水的ATP 二钠盐（ATP-Na2·3H2O）为白色晶体或类白色粉末，无臭，微有酸味，有吸湿性，易溶于水，难溶于乙醇、乙醚、苯、氯仿。在水中溶解后呈氢型的钠盐、钡盐或汞盐。在碱性溶液（pH10）中较稳定，25℃时每月约分解3%，在稀碱作用下水解成5'-AMP，在酸作用下则水解产生核苷和碱基。pH5、90℃加热70 h，可完全水解为腺苷。

ATP二钠分子中的碱基部分含有共轭双键，具有吸收紫外光的特性，在pH为2时吸光度的比值：A250/A260=0.85，A280/A260=0.22，A290/A260＜0.1。

ATP二钠盐是两性化合物，水解时其—NH2变成阳离子，磷酸基变成阴离子，解离度大于ADP和AMP，可与树脂交换吸附。ATP二钠盐能与可溶性汞盐和钡盐形成不溶于水的沉淀物，利用这种性质可分离ATP。

（二）确定生产技术、生产原料和工艺路线

（1）确定生产技术：生化制药技术。

（2）确定生产原料：兔肌肉。

（3）确定生产工艺路线，如图1-8-3所示。

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图1-8-3　三磷酸腺苷的生产工艺路线

二、生产工艺过程

（1）兔肉松的制备：将兔体冰浴降温，迅速拆去骨，绞碎，加入兔肌肉质量3～4倍的冷95%乙醇，搅拌30 min，过滤，压榨，制成肉糜。再将肉糜捣碎，以2～2.5倍量的冷95%乙醇同上操作处理1次，然后置于预沸的乙醇中（乙醇为用过两次的），继续加热至沸，保持5 min，取出兔肉，迅速置于冷乙醇中降温至10℃以下，过滤，压榨，肉饼再捣碎，分散在盘内，冷风吹干至无乙醇味为止，即得兔肉松。

（2）提取：取兔肉松，加入4倍量冷蒸馏水，搅拌提取30 min，过滤，压榨成肉饼，捣碎后再加3倍量的冷蒸馏水提取1次。合并2次滤液，按总体积加入4%冰乙酸，再用6 mol/L盐酸调pH为3，冷处静置3 h，经布氏漏斗过滤至澄清。

（3）吸附：取处理好的氯型201×7或717型阴离子交换树脂装入层析柱，柱高与直径之比以（3～5）∶1为宜，用pH为3的水将柱平衡。提取液上柱，流速控制在0.6～1 mL/（cm2·min）左右，吸附ATP。上柱过程中用DEAE-C（二乙氨基乙基纤维素）薄板检查，待出现AMP或ADP斑点时可收集AMP和ADP。继续进样，待追踪检查出现ATP斑点时，说明树脂已被ATP饱和，停止上柱。

（4）洗脱：饱和ATP柱用pH3、0.03 mol/L的氯化钠溶液洗涤柱上滞留AMP、ADP及无机盐等，流速控制在1 mL/（cm2·min）左右。薄层检查无AMP、ADP斑点并有ATP斑点出现时，再用pH3.8、1 mol/L的氯化钠溶液洗脱ATP，流速为0.2～0.4 mL/（cm2·min），收集洗脱液。操作温度为0～10℃，以防ATP分解。

（5）除热原、杂质：将洗脱液按总体积计，以0.6%的比例加入硅藻土（CP），以0.4%的比例加入活性炭后，搅拌10 min，除去热原及杂质。用4号垂熔漏斗过滤，收集ATP滤液。

（6）结晶、干燥：用6 mol/L盐酸调节ATP滤液pH至2.5～3，在28℃的水浴中恒温，加入3～4倍量ATP溶液的95%乙醇，不断搅拌，使ATP二钠结晶，用4号垂熔漏斗过滤，分别用无水乙醇、乙醚洗涤1～2次，收集ATP二钠晶体，置于五氧化二磷干燥器内真空干燥，即得成品。

（7）质量检测。

①澄明度　取本品少量，溶于注射用水或生理盐水中，溶液应澄清、透明、无色。

②pH　取本品少量，溶于无离子水中，pH应为3.8～5.0。

③含水量　用费休定水法（见《中国药典》）测定，水分含量不超过6%。

④硫酸盐含量　依《中国药典》检查，不得超过1.5%。

⑤重金属含量　小于0.0010%。

⑥蛋白质含量　用30%磺基水杨酸法鉴定，不得有蛋白质反应。

⑦汞含量　用脎腙法鉴定，同空白。

⑧热原　按《中国药典》检查，应符合规定。

⑨含量测定　ATP在生产中易带进ADP等杂质，储存中也易分解成ADP等，故多采用纸色谱或纸电泳分离ATP后的分光光度法测定。

纸电泳分离用pH3.0、0.05 mol/L的柠檬酸盐缓冲液，电压梯度为20 V/cm。

a.纸色谱法。

纸色谱展开剂用异丁酸-氨水（1 mol/L）-乙二胺四乙酸二钠溶液（0.1 mol/L）（100∶60∶1.6）或1%硫酸铵溶液-异丙醇（1∶2）。

将样品配成10 mg/mL的溶液，取10μL点样（色谱滤纸先用1 mol/L甲酸溶液浸泡过夜，次日取出，用水漂洗至洗液的pH不低于4为止，吹干，可除去纸中的金属离子，使ATP、ADP和AMP的斑点集中），同一样品做3点，纸色谱后将ATP样点剪下，并剪下与样点面积相近的空白滤纸，分别用0.01 mol/L盐酸5 mL，浸洗1～2 h，将斑点洗脱，倾取上清液，依照紫外-可见分光光度法，在260 nm波长处测定吸光度，减去滤纸空白吸光度的平均值，按摩尔吸光系数计算ATP含量。

b.纸电泳法。

取本品，精密称量，加水制成1 mL中含10 mg的溶液，依照纸电泳法测定，电泳完毕，取出，吹干，置于紫外灯（254 nm）下检视，用铅笔画出滤纸最前端的紫色斑点，剪下供试品斑点和与斑点面积相近的空白滤纸，剪成细条，分别放入试管中，精密加入盐酸（0.01 mol/L）5 mL，摇匀，放置1 h，倾取上清液，依照分光光度法，在（257±1）nm波长处测定吸光度，减去滤纸空白吸光度的平均值，按C10 H14 N5 Na2 O13 P3的百分吸收系数（ pagenumber_ebook=204,pagenumber_book=191 ）为263计算含量。

生产三磷酸腺苷的方法与流程优化

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