核酸类药物的生产方法详解

2023-06-24 理论教育版权反馈

【摘要】：至于核苷酸、碱基的生产，则可用水解相应的核酸的方法。有些非天然或含量较少的核苷酸、核苷和碱基则用酶法合成，或用特异的发酵方法生产。必须去掉杂质，才能消除干扰，准确测定核酸含量。制备RNA的材料大多选择动物的肝、肾、脾等含核酸丰富的组织，所要制备的RNA种类不同，选取的材料也各有不同。核酸含量测定可用下述的预处理方法。将此沉淀物经酸处理法或碱处理法处理，可将RNA与DNA分开。

在真核生物细胞中，RNA主要存在于细胞质中，约占总RNA的90%；DNA则主要存在于细胞核中，占总DNA的98%，另2%存在于线粒体和叶绿体中。由于RNA和DNA存在于细胞中的不同部位，所以它们的预处理是相关的，同一资源可用于生产RNA，又可用于生产DNA。至于核苷酸、碱基的生产，则可用水解相应的核酸的方法。有些非天然或含量较少的核苷酸、核苷和碱基则用酶法合成，或用特异的发酵方法生产。

（一）材料的选择与预处理

在一些生物材料中，除含有核酸外，还有许多杂质，如磷蛋白、糖类、磷脂、核苷酸类辅酶和游离核苷酸等。必须去掉杂质，才能消除干扰，准确测定核酸含量。因此，样品必须预处理，如图1-8-1所示。

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图1-8-1　核酸材料的预处理

一般先要将生物组织细胞在低温下磨碎成匀浆，然后用冷的稀三氯乙酸或1%的高氯酸溶液在低温下抽提几次，离心，去上清液，即去掉酸溶性小分子物质，如含磷化合物、糖、氨基酸、核苷酸等。沉淀为蛋白质、核酸、脂类、多糖等，再用有机溶剂（乙醇、乙醚、氯仿等）抽提去掉脂溶性的磷脂等物质，残余物为不溶于酸的非脂化合物，主要成分是DNA、RNA、蛋白质和少量其他含磷化合物。再进一步用下面两种方法处理，测定DNA和RNA。

（1）酸处理法　经预处理的核酸样品，用5%三氯乙酸或6%高氯酸溶液在90℃下提取15 min，DNA和RNA都成为酸溶性物提取出来，用定糖法分别测定DNA和RNA含量。该法简便快速，但没有把DNA和RNA分开，干扰因素多，不十分准确。

（2）碱处理法　经预处理的核酸样品，用温热（37℃）的稀碱液（0.3～1 mol/L氢氧化钾或氢氧化钠溶液）保温18 h，使RNA降解为酸溶性的单核苷酸，而DNA则不发生降解。然后用酸中和，再用三氯乙酸或高氯酸进行酸化，使来自RNA的核苷酸存于上清液中，离心分离，测定DNA和RNA含量。如上清液中存在无机磷和其他含磷化合物，可将无机磷酸盐沉淀后测定酸溶性上清液的总磷量和无机磷量，以总磷量减去无机磷量即为RNA的磷量。

（二）制备方法

1.RNA的制备

（1）材料的选择和预处理。

制备RNA的材料大多选择动物的肝、肾、脾等含核酸丰富的组织，所要制备的RNA种类不同，选取的材料也各有不同。工业生产上，则主要采用啤酒酵母、面包酵母、酒精酵母、白地霉、青霉等真菌的菌体为原料。例如酵母和白地霉，其RNA含量丰富，易于提取，而其DNA含量则较少，所以它们是制备RNA的好材料。

对于动物组织，预处理过程如下：先把组织捣碎，制成组织匀浆，然后利用0.14 mol/L氯化钠溶液能溶解RNA核蛋白而不能溶解DNA核蛋白这一特性，将组织匀浆中含有RNA的核糖核蛋白提取出来（含有DNA的细胞核物质则留在沉淀中），再调节pH为4.5，RNA仍保留在溶液中，核蛋白则成为沉淀，从而将两者分开。

核酸含量测定可用下述的预处理方法。将材料用组织匀浆器捣碎后，先用5%～10%的三氯乙酸（TCA）或过氯酸（PCA）溶液处理，以除去其中的酸溶性含磷化合物，然后将残留物用有机溶剂（如乙醇、乙醚等）处理，以除去脂溶性含磷化合物（主要为磷脂类物质）。留下的沉淀物为不溶于酸的非脂类含磷化合物，其中有RNA、DNA、蛋白质和少量其他含磷化合物。将此沉淀物经酸处理法或碱处理法处理，可将RNA与DNA分开。如图1-8-2所示。

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图1-8-2　核酸含量测定的材料预处理

①酸处理法　将经酸和有机溶剂处理后的残留物用1 mol/L过氯酸溶液于4℃下处理18 h，从中抽提出RNA，沉淀部分再用1 mol/L过氯酸溶液80℃下处理30 min（植物材料用0.5 mol/L过氯酸溶液70℃下处理20 min），提取DNA。以上提取液即可用定糖法、定磷法或紫外分光光度法测定。此法的缺点是有些材料的DNA在冷过氯酸抽提时被少量提取，从而使RNA部分中混杂有少量DNA。

②碱处理法　将残留物用1 mol/L氢氧化钠溶液于37℃下处理过夜，则RNA被碱解为碱溶性核苷酸，DNA不降解。加入过氯酸或三氯乙酸使溶液酸化，至酸浓度为5%～10%，此时RNA的分解产物溶解在上清液中，DNA等则被沉淀下来。此法的优点是RNA和DNA分开得较为彻底，缺点是RNA中还含有其他含磷化合物（如磷肽、磷酸肌醇等），用定磷法测定RNA时结果偏高。

（2）提取。

目前最广泛使用的是酚法或其改良方法，此外还有乙醇沉淀法及去污剂处理法等。

①酚法　酚法最大的优点是能得到未被降解的RNA。酚溶液能沉淀蛋白质和DNA，经酚处理后RNA和多糖处于水相中，可用乙醇使RNA从水相中析出。随RNA一起沉淀的多糖则可通过以下步骤去除：用磷酸缓冲液溶解沉淀，再用2-甲氧乙醇提取RNA，透析，然后用乙醇沉淀RNA。改良后的皂土酚法，由于皂土能吸附蛋白质、核酸酶等杂质，因此其稳定性比酚法好，其RNA得率也比酚法高。

②乙醇沉淀法　将核糖核蛋白溶于碳酸氢钠溶液中，然后加入含少量辛醇的氯仿，长时间连续振荡多次，除去蛋白质，RNA留在水溶液中，加入乙醇使RNA以钠盐的形式沉淀下来。或用乙醇使核糖核蛋白变性，以10%氯化钠溶液提取RNA，再用2倍量的乙醇沉淀RNA。

③去污剂处理法　在核糖核蛋白溶液中加入1%的十二烷基磺酸钠（SDS）、乙二胺四乙酸钠（EDTA）、三乙醇胺、苯酚、氯仿等以除去蛋白质，使RNA留在上清液中，然后用乙醇沉淀RNA。或者先用2 mol/L盐酸胍溶液38℃下溶解蛋白质，再冷却至0℃左右，使RNA沉淀，沉淀中混有少量蛋白质，然后用去污剂处理。

（3）纯化。

用上述方法取得的RNA一般是多种RNA的混合物，这种混合RNA可以直接作为药物使用，如以动物肝脏为材料制备的RNA即可作为治疗慢性肝炎、肝硬化等疾病的药物。但有时需要均一性的RNA，常用的纯化方法有密度梯度离心法、柱色谱法和凝胶电泳法等。

①密度梯度离心法　一般采用蔗糖溶液作为分离RNA的介质，建立从管底向上逐渐降低的浓度梯度，管底浓度为30%，最上面为5%；然后将混合RNA溶液小心地放于蔗糖面上，经高速离心数小时后，大小不同的RNA分子即分散在相应密度的蔗糖部位中。然后从管底依次收集一系列样品，分别在260 nm波长处测其吸光度并绘成曲线。合并同一峰内的收集液，即可得到相应的较纯RNA。

②柱色谱法　用于分离RNA的柱色谱法有多种系统，较常用的载体有二乙胺乙基（DEAE）纤维素、葡聚糖凝胶、DEAE-葡聚糖凝胶以及MAK（甲基化清蛋白吸附于硅藻土）等。混合RNA从色谱柱上洗脱下来时一般按相对分子质量从小到大的顺序，分步收集，即可得到相应的RNA。

③凝胶电泳法　各种RNA分子所带电荷与其质量之比都非常接近，故一般电泳法无法使之分离。但若用具有分子筛作用的凝胶作载体，则不同大小的RNA分子在电泳中将具有不同的泳动速度，从而可分离纯化RNA。琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶即有这种作用，故常被用作分离RNA的载体。

（4）含量测定。

RNA是磷酸和戊糖通过磷酸二酯键形成的长链，所以磷酸或戊糖的量与RNA的量成正比，因此，可通过测定磷酸或戊糖的量来断定RNA的量，前者称为定磷法，后者称为定糖法。

①定磷法　此法首先必须将RNA中的磷水解成无机磷。常用浓硫酸或过氯酸将RNA消化，使其中的磷变成正磷酸。正磷酸在酸性条件下与钼酸作用生成磷钼酸，后者在还原剂（如抗坏血酸、α-1，2，4-氨基萘酚磺酸或氧化亚锡等）存在下，立即还原成钼蓝。钼蓝的最大光吸收在660 nm波长处，在一定浓度范围内，溶液在该处的吸光度和磷的含量成正比，从而可通过测吸光度，用标准曲线法计算出样品含磷量。根据对RNA和DNA的分析，已知前者的含磷量为9.4%，后者的为9.9%，于是可从含磷量推算出核酸的含量。

用抗坏血酸作还原剂时，比色的最适范围在含磷量1 μg/mL左右，在室温下颜色可稳定60 h以上。用α-1，2，4-氨基萘酚磺酸作还原剂时，比色的最适范围在含磷量为2.5～25.0 μg/mL，室温下颜色可稳定20～25 min。前者重复性好，后者测定范围较宽。

钼蓝反应非常灵敏，若核酸制品中含有微量的磷、硅酸盐、铁离子，以及酸度偏高或偏低，都会影响测定结果。因此，测试时样品应尽量除去杂质，反应条件要严格控制，试剂要可靠。

②定糖法　此法先用盐酸水解RNA，使核糖游离出来，并进一步变成糠醛，然后与地衣酚（又称苔黑酚、3，5-二羟甲苯）反应。产物呈鲜绿色，在670 nm波长处有最大吸收，当RNA浓度在20～200 μg/mL范围时，吸光度与RNA的浓度成正比，从而可测出RNA的含量。此法的显色试剂为地衣酚，故又称地衣酚法，反应需用三氯化铁作催化剂。

地衣酚反应的特异性不强，凡是戊糖均有反应，因此，对被测溶液的纯度要求较高，最好能同时测定样品中的DNA含量以校正所测得的RNA含量。

2.DNA的制备

（1）材料的选择与预处理　制备DNA的材料一般用小牛胸腺或鱼精，这类组织的细胞体积较小，细胞质的含量极少，故这类组织的DNA含量高。预处理方法与RNA的类似，只不过制备DNA时用0.14 mol/L氯化钠溶液溶解RNA的目的是去掉RNA而留下DNA。

（2）提取与纯化　将含DNA的沉淀物用0.14 mol/L氯化钠溶液反复洗涤，尽量除去RNA，然后用生理盐水溶解沉淀物，并加入去污剂（SDS溶液）使DNA与蛋白质解离、变性，此时溶液变黏稠。冷藏过夜后，再加入氯化钠溶液使DNA溶解，当盐浓度达1 mol/L时，溶液黏稠度下降，DNA处在液相，蛋白质沉淀。离心去杂质，得乳白状清液，过滤后加入等体积的95%乙醇，使DNA析出，得白色纤维状粗制品。在此基础上反复用去污剂除去蛋白质等杂质，可得到较纯的DNA。当DNA中含有少量RNA时，可用核糖核酸酶、异丙醇等处理，用活性炭柱色谱以及电泳去除。

分离混合DNA可采用与分离、纯化RNA类似的方法。

（3）含量测定　DNA的含量测定也有定磷法和定糖法两种方法。定磷法与用于RNA测定的定磷法相同，DNA的含磷量为9.9%，从而可根据定磷的结果推算出DNA的含量。定糖法又称二苯胺法。在酸性溶液中，将DNA与二苯胺共热，生成蓝色化合物，该化合物在595 nm波长处有最大吸收。当DNA浓度在20～200 μg/mL范围时，吸光度与DNA浓度成正比，从而可测出DNA的含量。若在反应液中加入少量乙醛，则可在室温下将反应时间延长至18 h以上，从而使灵敏度提高，将其他物质造成的干扰降低。

3.核苷酸、核苷及碱基的生产

（1）主要生产方法。

①直接提取法　类似于RNA和DNA的生产，可直接从生物材料中提取。此法的关键是去杂质，被提取物不管是呈溶液状态还是呈沉淀状态，都要尽量与杂质分开。为了制得精品，有时还需多次溶解、沉淀。从兔肌肉中提取ATP和从酵母或白地霉中提取辅酶A即是采用此法。

②水解法　核苷酸、核苷和碱基都是RNA或DNA的降解产物，所以当然能通过相应的原料水解制得。水解法又分酶水解法、碱水解法和酸水解法三种。

③酶合成法　利用酶系统和模拟生物体条件生产核苷酸，如酶促磷酸化生产ATP。

④光合磷酸化法　在离体条件下利用植物叶中的叶绿体（通常用菠菜叶），把光能转变成高能磷酸键，固定在ADP上，使ADP形成ATP。

⑤微生物发酵法　利用微生物的特殊代谢使某种代谢物积累，从而获得该产物的方法称为发酵法。如在微生物正常代谢下肌苷酸是中间产物，不会积累，但当其突变为腺嘌呤营养缺陷型后，该中间物不能转化成AMP，于是在前面的代谢不断进行的情况下，大量的肌苷酸就成为终产物而积累在发酵液中。事实上肌苷酸的生产正是采用了此法。

（2）含量测定。

核苷酸、核苷及碱基均有其独特的紫外吸收曲线，采用紫外分光光度法，先将碱基、核苷或核苷酸用某种溶剂配成一定浓度的溶液，然后在某一特定波长下测定该溶液的吸光度，通过计算即可得出该物质的含量。

核酸类药物的生产方法详解

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