如何优化前列腺素E2的生产？

2023-06-24 理论教育版权反馈

【摘要】：PGA、PGB分别表示PGE经酸或碱处理后生产的产物。目前多采用羊精囊为酶原、花生四烯酸为前体生产PGE2。图1-7-3前列腺素E2的结构式PGE2为白色晶体，熔点为68～69℃，溶于乙酸乙酯、丙酮、乙醚、甲醇及乙醇等有机溶剂，不溶于水。图1-7-4前列腺素E2生产工艺流程二、生产工艺过程酶的制备：取-30℃冷冻的羊精囊，除去杂质，按1 kg加1 L 0.154 mol/LKCl溶液，分次加入匀浆，然后4000 r/min离心20 min，取上层液用双层纱布过滤，滤渣再用KCl溶液匀浆，如上法离心过滤。

一、生产前准备

（一）查找资料，了解前列腺素生产的基本知识

前列腺素（PG）通常是以花生四烯酸为生物合成前体，经酶或非酶转化生成的以前列腺烷酸为骨架的内源性生理活性物质，生理作用极为广泛，共分八类。易溶于乙醚的PG用E表示，即PGE；易溶于磷酸盐溶液的PG用F表示，即PGF。PGE主要包括PGE1、PGE2、PGE3，其中PGE1和PGE2应用较为广泛；PGF主要包括PGF1α、PGF2α、PGF3α。PGA、PGB分别表示PGE经酸或碱处理后生产的产物。

PG合成酶存在于动物组织中，如羊精囊、羊睾丸、兔肾髓质及大鼠肾髓质等，以羊精囊中含量最高。目前多采用羊精囊为酶原、花生四烯酸为前体生产PGE2。

PGE2为含羰基及羟基的二十碳五元环不饱和脂肪酸，化学名称为11α，15（S）-二羟基-9-羰基-5-顺-13-反前列双烯酸，分子式为C20H32O5，相对分子质量为352，结构如图1-7-3所示。

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图1-7-3　前列腺素E2的结构式

PGE2为白色晶体，熔点为68～69℃，溶于乙酸乙酯、丙酮、乙醚、甲醇及乙醇等有机溶剂，不溶于水。在酸性和碱性条件下可分别异化为PGA2和PGB2，紫外吸收波长分别为217 nm和278 nm。

（二）确定生产技术、生产原料和工艺路线

（1）确定生产技术：酶解提取技术。

（2）确定生产原料：羊精囊。

（3）确定生产工艺路线，如图1-7-4所示。

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图1-7-4　前列腺素E2生产工艺流程

二、生产工艺过程

（1）酶的制备：取-30℃冷冻的羊精囊，除去杂质，按1 kg加1 L 0.154 mol/LKCl溶液，分次加入匀浆，然后4000 r/min离心20 min，取上层液用双层纱布过滤，滤渣再用KCl溶液匀浆，如上法离心过滤。合并上清液，用2 mol/L柠檬酸调pH为5.0，4000 r/min离心，弃去上清液。用100 mL pH8.0、0.2 mol/L磷酸缓冲液洗出沉淀，再加100 mL 6.25 μmol/L EDTA-Na2溶液搅匀，用2 mol/L KOH溶液调pH为8.0，得酶混悬液。

（2）转化：取上述酶制剂混悬液，每升酶混悬液加入用少量水溶解的氢醌40 mg和谷胱甘肽500 mg。再按1 kg羊精囊量加1 g花生四烯酸，搅拌通氧，升温至37℃，并于37～38℃转化1 h，加3倍体积丙酮终止反应，得反应液。

（3）提取：将反应液过滤、压干。滤渣用少量丙酮抽提1次，于45℃减压浓缩，回收丙酮，浓缩液用4 mol/L盐酸调pH为3.0，以2/3体积乙醚分3次萃取，取醚层以2/3体积0.2 mol/L磷酸缓冲液分3次萃取。水层再以2/3体积石油醚分3次萃取脱脂。取水层，加4 mol/L盐酸调pH为3.0，加2/3体积二氯甲烷分3次萃取，二氯甲烷层用少量水洗涤，去水层，二氯甲烷层加无水硫酸钠密封于冰箱内脱水过夜，滤出硫酸钠，滤液于40℃减压浓缩，得黄色油状物，即PG粗品。

（4）PGE2分离：1 g PG粗品用15 g100～160目活化硅胶。湿法装柱，用少量氯仿溶解PG粗品，过柱层析分离，依次以氯仿、氯仿-甲醇（V氯仿∶V甲醇=98∶2）、氯仿-甲醇（V氯仿∶V甲醇=96∶4）三种溶液洗脱，分别收集PGA和PGE洗脱液，硅胶柱层析鉴定，将相同洗脱液合并，得PGA和PGE部分。将PGE洗脱液在35℃以下减压浓缩，得PGE粗品。

（5）纯化：1 g PGE粗品用20 g硅胶。取200～250目10倍PGE质量的活化硝酸银硅胶混悬于乙酸乙酯-冰乙酸-石油醚-水（体积比为220∶22.5∶125∶5，石油醚的沸点为90～120℃）展开剂中，湿法装柱。将粗晶用少量的同一展开剂溶解，上柱，洗脱。通过硝酸银硅胶G薄层追踪鉴定，分别收集PGE1和PGE2洗脱液，分别于35℃以下充氮浓缩至无乙酸味，用适量乙酸乙酯溶解，少量水洗酸，加生理盐水除银。乙酸乙酯液用无水硫酸钠充氮密封于冰箱中脱水过夜，过滤，滤液于35℃以下充氮减压浓缩除尽有机溶剂，得PGE2纯品。经乙酸乙酯-己烷结晶可得PGE2结晶品。PGE1可用少量乙酸乙酯溶解后置于冰箱中结晶（晶体熔点为115～116℃）。

三、质量检验

PGE2为无色或微黄色无菌澄清透明醇溶液，0.5 mL内含2 mg PGE2，其含量应不低于标示量的85%。

（一）鉴别

（1）取本品适量，溶于无水甲醇中，于278 nm波长处应无特征吸收峰，若加等体积1 mol/L KOH溶液，室温异构化15 min，278 nm波长处应有特征吸收峰。

（2）经硝酸银硅胶G（硝酸银与硅胶G的质量比为1∶10）薄层鉴定，PGE2注射液应只有PGE2点和微量PGA。

（3）取本品1滴，加1%间二硝基苯甲醇液1滴，再加10%KOH甲醇溶液1滴，摇匀，显紫红色。

（二）检验

（1）含银量不超过0.02%。

（2）安全性试验应符合《中国药典》（2010年版）注射剂无菌检查项下有关规定。