优化香菇多糖生产工艺

2023-06-24 理论教育版权反馈

【摘要】：香菇多糖主要分布于肝，其次为脾、肺、肾等脏器。目前主要用于恶性肿瘤的辅助治疗。图1-6-5香菇多糖结构式香菇多糖为白色粉末。香菇多糖具有广泛的药理学活性，如免疫调节作用，抗肿瘤、抗衰老作用，对化学物质所致肝损害具有保护作用，可作为LAK细胞活性上向调节剂等。香菇多糖毒副作用小，小鼠急性毒性试验表明静脉给药LD50为304.5 mg/kg，腹腔给药LD50＞2500 mg/kg。

一、生产前准备

（一）查找资料，了解香菇多糖生产的基本知识

香菇多糖（lentinan）是从担子菌纲伞菌科真菌香菇（Lentinus edodes（Berk）Sing）子实体中提取、分离纯化而获得的均一组分的多糖，香菇多糖是以β-（1→3）-葡萄糖为主链，β-（1→6）-葡萄糖为侧链的葡聚糖。其重复结构单位（图1-6-5）一般含有7个葡萄糖残基，其中2个在侧链上。

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图1-6-5　香菇多糖结构式

香菇多糖为白色粉末。香菇多糖的抗肿瘤作用与其化学结构尤其是β-（1→3）链关系密切。采用凝胶过滤法（HPLC）和激光拉曼散射法测得其相对分子质量为4×105～8×105。香菇多糖具有广泛的药理学活性，如免疫调节作用，抗肿瘤、抗衰老作用，对化学物质所致肝损害具有保护作用，可作为LAK细胞活性上向调节剂等。香菇多糖毒副作用小，小鼠急性毒性试验表明静脉给药LD50为304.5 mg/kg，腹腔给药LD50＞2500 mg/kg。六个月的大鼠长期毒性试验和生殖毒性的研究，均未发现明显异常。亚急性毒性试验中分别给药2.5 mg/kg、300 mg/kg，结果对试验动物正常生长和一般状态均无明显影响。病理学检查大鼠心、肺、肝、肾、胃等脏器均未见毒性作用，也未见致畸胎作用。香菇多糖给药后血浓度曲线（大鼠）半衰期t1/2为1.9 h，其后72 h呈双指数衰减。香菇多糖主要分布于肝，其次为脾、肺、肾等脏器。绝大部分经尿排出。目前主要用于恶性肿瘤的辅助治疗。

（二）确定生产技术、生产原料和工艺路线

（1）确定生产技术：生物化学制药技术。

（2）确定生产原料：香菇子实体。

（3）确定生产工艺路线：如图1-6-6所示。

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图1-6-6　香菇多糖的生产工艺路线

二、生产工艺过程

（1）提取　香菇子实体经冲洗、破碎后，用蒸馏水于80～100℃下提取2次，每次8 h，加水量分别为投料量的5倍和3倍，所得悬液在4000 r/min 下离心30 min，去除滤渣，滤液蒸发浓缩至原体积的1/4。

（2）沉淀　加入等量乙醇进行沉淀，收集沉淀物，用乙醇洗涤，得粗品。

（3）去蛋白质　将粗品研成细粉，加蒸馏水匀浆，水量逐渐增至投料量的100倍，膨胀一昼夜，再加100倍水稀释，搅拌2 h，静置沉淀后，滴加0.2 mol/L CTAOH试剂至pH12，离心分离，收集沉淀物。

（4）洗涤　沉淀物依次用乙醇、稀酸（10%乙酸）、浓酸（50%乙酸）和碱液（6%NaOH溶液）进行洗涤，醇洗、碱洗各2次，每次用10倍量的醇、碱液洗涤即可，稀酸洗2次，浓酸洗1次，每次用5倍量的稀酸、浓酸洗涤即可。

（5）沉淀　碱洗后的滤液以5倍量乙醇进行沉淀，沉淀用5倍量乙醇洗涤2次，最后用乙醚洗涤，得成品。

三、检验方法

香菇多糖的含量测定方法有滴定法、苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法、3，5-二硝基水杨酸法和高效液相色谱法等，下面以苯酚-硫酸法为例介绍香菇多糖的含量的具体测定方法。糖类物质在浓硫酸作用下脱水，生成糠醛或糠醛衍生物，糠醛能与芳香族化合物缩合生成红色化合物。该有色化合物在490 nm波长处有最大吸收，测定490 nm波长处的吸光度，就能计算出多糖浓度，这是苯酚-硫酸法测定多糖的基本原理。具体操作如下。

1.葡萄糖标准溶液的配制

精密称取105℃干燥至恒重的葡萄糖100.0 mg，加蒸馏水溶解并定容于100 mL容量瓶中，摇匀，配成1 mg/mL葡萄糖标准溶液备用。

2.5%苯酚试剂的配制

将苯酚水浴加热溶解后称取100 g，加铝片0.1 g（先用1∶6的盐酸除去铝片表面氧化铝，再称量使用），加入碳酸氢钠30 g，蒸馏，收集178～182℃的馏分，取馏出液7.5 g，加入蒸馏水150 mL，得5.0%的苯酚溶液，置于棕色瓶中备用。

3.标准曲线的绘制

以葡萄糖作为标准品，采用苯酚-硫酸法，用紫外分光光度计测定多糖含量。精密吸取已配制的葡萄糖标准溶液0.5 mL、1 mL、1.5 mL、2 mL、2.5 mL、3 mL，置于6个50 mL容量瓶中，加蒸馏水至刻线，摇匀。分别精密吸取2 mL，加入5%苯酚溶液1 mL，摇匀，迅速加入5 mL浓硫酸，振摇5 min，置沸水浴中加热15 min，然后置冷水浴中冷却30 min，以蒸馏水作为空白对照，在400～600 nm内扫描，最大吸收波长为490 nm。在490 nm波长处测吸光度。以浓度为纵坐标，吸光度为横坐标，绘制标准曲线，得出葡萄糖标准品浓度（μg/mL）与吸光度的回归方程，在2.5～15.0μg/mL范围内呈线性关系。

4.含量测定

取2 mL滤液，加入5%苯酚溶液1 mL，摇匀，迅速加入5 mL浓硫酸，振摇5 min，置于沸水浴中加热15 min，然后置于冷水浴中冷却30 min，即以蒸馏水作为空白对照，在490 nm波长处用分光光度计测吸光度，从而得出香菇多糖浓度。

5.质量标准

香菇多糖是类白色或浅黄色粉末，无味，有吸湿性。在水、甲醇、乙醇或丙酮中几乎不溶，在0.5 mol/L NaOH溶液中溶解。按干燥品计算，含香菇多糖应不得少于92.0%。

优化香菇多糖生产工艺

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