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2023-06-24
一、生产前准备
(一)查找资料,了解透明质酸生产的基本知识
透明质酸是由(1→3)-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖-(1→4)-O-β-D-葡萄糖醛酸的双糖重复单位所组成的酸性多糖,相对分子质量为50万~200万。透明质酸的分子式为(C14 H21 NO11)n。
透明质酸为白色、无定形固体,无臭无味,有吸湿性,溶于水,不溶于有机溶剂,水溶液的比旋光度为-800~-700,具有较高的黏度。一些因素会影响透明质酸溶液的黏度,如pH低于或高于7.0,或有透明质酸酶存在时引起分子中糖苷键的水解。许多还原性物质(如半胱氨酸、焦性没食子酸、抗坏血酸)、重金属离子和紫外线、电离辐射等也能引起分子间的解聚而造成黏度下降。
透明质酸具有很强黏性,对骨关节具有润滑作用,还能促进物质在皮肤中的扩散、调节细胞表面和细胞周围的Ca2+、Mg2+、K+、Na+运动。在组织中的强力保水作用是其最重要的生理功能之一,故被称为理想的天然保湿因子。其理论保水值高达800 mL/g,在结缔组织中的实际保水值为80 mL/g。此外,透明质酸还有促进纤维增生、加速伤口愈合作用。透明质酸作为药物主要应用于眼科治疗手术,如晶体植入、摘除,角膜移植,抗青光眼手术等,还用于治疗骨关节炎、外伤性关节炎和滑囊炎以及加速伤口愈合。透明质酸在化妆品中的应用更为广泛,它能保持皮肤湿润光滑、细腻柔嫩,富有弹性,具有防皱抗皱、美容保健和恢复皮肤生理功能的作用。
(二)确定生产技术、生产原料和工艺路线
(1)确定生产技术:生物制药下游技术。
(2)确定生产原料:鸡冠。
(3)确定生产工艺路线,如图1-6-4所示。
图1-6-4 透明质酸生产工艺流程
二、生产工艺过程
(1)提取 新鲜鸡冠用丙酮脱水后粉碎,加蒸馏水浸泡提取24 h,重复3次,合并滤液。
(2)除蛋白、沉淀 提取液与等体积CHCl3混合搅拌3 h,分出水相,加2倍量95%乙醇,收集沉淀,丙酮脱水,真空干燥,得粗品透明质酸。
(3)酶解 将粗品透明质酸溶于0.1 mol/L NaCl溶液,用1 mol/L盐酸调pH至4.5~5.0,加入等体积CHCl3搅拌,分出水层,用稀NaOH溶液调pH为7.5,加链霉蛋白酶,于37℃酶解24 h。
(4)配位、解离、沉淀、干燥 酶解液用CHCl3除杂蛋白,然后加入等体积1%CPC溶液,放置后,收集沉淀,用0.4 mol/LNaCl溶液解离,离心,取出清液,加入3倍量95%乙醇,收集沉淀,丙酮脱水,真空干燥,得透明质酸成品。
三、检验方法
透明质酸分子为葡萄糖醛酸与氨基葡萄糖双糖单位所组成,因此又可以通过测定分子中的某一残基单糖来计算样品中透明质酸的含量。通常有化学法和生化分析法。
化学法主要采用Elson-Morgan法测定氨基葡萄糖含量和用Bitter的硫酸咔唑法测定葡萄糖醛酸的含量。
生化分析法是用透明质酸酶水解透明质酸,然后用比色法测定产生的游离还原糖(氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸),本法特异性好、准确、可靠。还可以用电泳法分析透明质酸,样品经电泳后,用阿利新蓝染色、洗脱透明质酸染色区带,用比色法测定含量,此法结果也比较准确。
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