如何生产高效肝素？

2023-06-24 理论教育版权反馈

【摘要】：硫酸化程度高的肝素具有较高的降脂和抗凝活性。高度乙酰化的肝素，其抗凝活性降低甚至完全消失，而降脂活性不变。肝素是典型的抗凝血药，能阻止血液的凝结过程，用于防止血栓的形成。小剂量肝素用于防治高脂血症与动脉粥样硬化。肝素广泛分布于哺乳动物的肝、肺、心、脾、肾、胸腺、肠黏膜、肌肉和血液里。图1-6-2盐解-离子交换的肝素生产工艺流程②酶解-离子交换生产工艺流程如1-6-3所示。

一、生产前准备

（一）查找资料，了解肝素生产的基本知识

肝素是天然抗凝剂，是一种含有硫酸基的酸性黏多糖。其分子具有由六糖或八糖重复单位组成的线形链状结构。三硫酸双糖是肝素的主要双糖单位，L-艾杜糖醛酸是此双糖的糖醛酸。二硫酸双糖的糖醛酸是D-葡萄糖醛酸。三硫酸双糖与二硫酸双糖以2∶1的比例在分子中交替联结。肝素酶能使肝素降解成三硫酸双糖单位和二硫酸双糖单位。乙酰肝素酶Ⅱ能将四糖单位降解为一个三硫酸双糖单位和一个二硫酸双糖单位。肝素活性还与葡萄糖醛酸含量有关，活性高的分子片段其葡萄糖醛酸含量较高，艾杜糖醛酸含量较低。

硫酸化程度高的肝素具有较高的降脂和抗凝活性。高度乙酰化的肝素，其抗凝活性降低甚至完全消失，而降脂活性不变。小相对分子质量肝素（相对分子质量为4000～5000）具有较低的抗凝活性和较高的抗血栓形成活性。

肝素是典型的抗凝血药，能阻止血液的凝结过程，用于防止血栓的形成。因为肝素在α-球蛋白参与下，能抑制凝血酶原转变成凝血酶。肝素还具有澄清血浆脂质、降低血胆固醇和增强抗癌药物等作用。临床广泛用作各种外科手术前后防治血栓形成和栓塞、输血时预防血液凝固和作为保存新鲜血液的抗凝剂。小剂量肝素用于防治高脂血症与动脉粥样硬化。广泛用于预防血栓疾病、治疗急性心肌梗死和肾病患者的渗血治疗，还可以用于清除小儿肾病形成的尿毒症。肝素软膏在皮肤病与化妆品中也已广泛应用。

肝素广泛分布于哺乳动物的肝、肺、心、脾、肾、胸腺、肠黏膜、肌肉和血液里。因此，肝素可由猪肠黏膜、牛肺、猪肺提取。其生产工艺主要有盐解-季铵盐沉淀法、盐解-离子交换法和酶解-离子交换法。肝素在组织内和其他黏多糖一起与蛋白质结合成复合物，因此肝素制备过程包括肝素蛋白质复合物的提取、解离和肝素的分离纯化两个步骤。

提取肝素多采用钠盐的碱性热水或沸水浸提，然后用酶（如胰蛋白酶、胰酶（胰脏）、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和细菌蛋白酶等）水解与肝素结合的蛋白质，使肝素解离释放。也可以用碱性食盐水提取，再经热变性并结合凝结剂（如明矾、硫酸铝等）除去杂蛋白。所得的粗提液仍含有未除尽的杂蛋白、核酸类物质和其他黏多糖，需经阴离子交换剂或长链季铵盐分离，再经乙醇沉淀和氧化剂处理等纯化操作，即得肝素成品。

（二）确定生产技术、生产原料和工艺路线

（1）确定生产技术：生物化学制药技术。

（2）确定生产原料：猪肠黏膜。

（3）确定生产工艺路线。

①盐解-离子交换生产工艺流程如图1-6-2所示。

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图1-6-2　盐解-离子交换的肝素生产工艺流程

②酶解-离子交换生产工艺流程如1-6-3所示。

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图1-6-3　酶解-离子交换的肝素生产工艺流程

二、生产工艺过程

（一）盐解-离子交换生产工艺过程

（1）提取　取新鲜猪肠黏膜投入反应锅内，按3%加入NaCl，用30%NaOH溶液调pH为9.0，于40～45℃保温提取2 h。继续升温至95℃，维持10 min，冷却至50℃以下，过滤，收集滤液。

（2）吸附　加入714强碱性Cl-型树脂，树脂用量为提取液的2%。搅拌吸附8h，静置过夜。

（3）洗涤　收集树脂，用水冲洗至洗液澄清，滤干，用2倍量1.4 mol/L NaCl溶液搅拌2 h，滤干。

（4）洗脱　用2倍量3 mol/L NaCl溶液搅拌洗脱8 h，滤干，再用1倍量3 mol/L NaCl溶液搅拌洗脱2 h，滤干。

（5）沉淀　合并滤液，加入等量95%乙醇沉淀过夜。收集沉淀，丙酮脱水，真空干燥得粗品。

（6）精制　将粗品肝素溶于15倍量1%NaCl溶液，用6 mol/L盐酸调pH为1.5左右，过滤至清，随即用5 mol/L NaOH溶液调pH为11.0，按3%量加入H2O2（H2O2浓度为30%），25℃放置。维持pH11.0，第2天再按1%量加入H2O2，调节pH为11.0，继续放置，共48 h，用6 mol/L盐酸调pH为6.5，加入等量的95%乙醇，沉淀过夜。收集沉淀，经丙酮脱水真空干燥，即得肝素钠成品。

（二）酶解-离子交换生产工艺过程

（1）酶解　取100 kg新鲜猪肠黏膜（总固体占5%～7%），加苯酚200 mL（0.2%），气温低时可不加。在搅拌下，加入已绞碎胰脏0.5～1 kg（0.5%～1%），用10%NaOH溶液调pH至8.5～9.0，升温至40～45℃，保温2～3 h。维持pH8.0，加入5 kgNaCl（5%），升温至90℃，用6 mol/L盐酸调pH为6.5，停止搅拌，保温20 min，过滤即得。

（2）吸附　取酶解液，冷却至50℃以下，用6 mol/L NaOH溶液调pH至7.0，加入5 kg D-254强碱性阴离子交换树脂，搅拌吸附5 h，收集树脂，用水冲洗至洗液澄清，滤干，用等体积2 mol/L NaCl溶液洗涤15 min，滤干，树脂再用2倍量1.2 mol/L NaCl溶液洗涤2次。

（3）洗脱　将树脂吸附物用50%量5 mol/L NaCl溶液搅拌洗脱1 h，收集洗脱液，再用1/3量3 mol/L NaCl溶液洗脱2次，合并洗脱液。

（4）沉淀　洗脱液经纸浆助滤，得清液，加入用活性炭处理过的90%体积的95%乙醇，冷处沉淀8～12 h，收集沉淀，按100 kg黏膜加入300 mL的比例，向沉淀中补加蒸馏水，再加4倍量95%乙醇，冷处沉淀6 h，收集沉淀，用无水乙醇洗1次，丙酮脱水2次，真空干燥，得粗品肝素。

（5）精制　将粗品肝素溶于10倍量2%NaCl溶液，加入4%KMnO4溶液（加入量为每亿单位肝素加入0.65 mol KMnO4）。加入方法：将KMnO4溶液调至pH8.0，预热至80℃，边搅拌边加入NaCl溶液，保温2.5 h。以滑石粉做助滤剂，过滤，收集滤液，调pH为6.4，加90%体积的95%乙醇，置于冷处沉淀6 h以上。收集沉淀，溶于1%NaCl溶液中（配成5%肝素钠溶液），加入4倍量95%乙醇，冷处沉淀6 h以上，收集沉淀，用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，真空干燥，得精品肝素。

三、检验方法

（一）生物检定法

测定肝素生物效价有硫酸钠兔全血法、硫酸钠牛全血法和柠檬酸羊血浆法。硫酸钠兔全血法是取肝素标准品和供试品，用健康家兔新鲜血液比较两者延长血凝时间的程度，以决定供试品的效价。抽取兔的全血，离体后立即加到一系列含有不同量肝素的试管中，使肝素与血液混匀后，测定其凝血时间。按统计学的要求，用生理盐水按等比级数稀释成不同浓度的高、中、低剂量稀释液，相邻两浓度之比不得大于10∶7。例如，高：中：低剂量分别为5 U/mL∶3.5 U/mL∶2.4 U/mL。

英国药典和日本药局方采用硫酸钠牛全血法，是取硫酸钠牛全血，加入凝血激酶（从牛脑提取）和肝素溶液，测定标准品与供试品的凝血时间，决定样品效价。美国药典用柠檬酸羊血浆法测定肝素效价，是取柠檬酸羊血浆，加入标准品和供试品，重钙化后，观察凝固程度。如标准品和供试品浓度相同，凝固程度也相同，则说明它们效价相同。

肝素的标准生物效价是以每毫克肝素（60℃、266.64 Pa真空干燥3 h）所相当的单位（U）数来表示。1U为24h内在冷处可阻止1 mL猫血凝结所需的最低肝素量。国际常用的标准品是WHO的第三次国际标准，以国际单位表示为173 IU/mg。我国使用中国食品药品检定研究院颁发的标准品（如S.6为158 IU/mg）。美国采用美国药典标准，称为美国药典单位（USPU）。曾对我国标准品S.6（158 IU/mg）用柠檬酸羊血浆法测定，结果为美国药典标准142.2 USPU/mg（此数可供参比）。

（二）天青A比色法

此法是以天青A与肝素结合后的吸光度变化为测定依据。以巴比妥缓冲液固定测定pH和离子强度，并以西黄芪胶为显色稳定剂，在505 nm波长处测定吸光度，结果与生物检定法接近，适用于肝素生产研究过程中控制检测。因为变色活性与黏多糖的阴离子强度有关，所以变色测定值也是抗凝血活性的有用参考指标。

如何生产高效肝素？

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