糖类药物的生产方法优化

2023-06-24 理论教育版权反馈

【摘要】：（二）多糖的生产多糖的生产包括提取、纯化、浓度的测定和纯度检查等环节。糖类遇浓硫酸脱水生成糠醛或其衍生物，可与蒽酮试剂结合产生颜色反应，反应后溶液呈蓝绿色，于620 nm波长处有最大吸收，吸光度与糖含量呈线性关系。

（一）单糖及其衍生物的生产

游离单糖及小分子寡糖，包括单糖（如葡萄糖、果糖、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖）、双糖类（如蔗糖、麦芽糖）、三糖类（如棉籽糖、龙胆糖）、四糖类（如来苏糖），以及多元醇类（如卫矛醇、甘露醇）等，易溶于冷水及温乙醇。可以用水或在中性条件下以50%乙醇为提取溶剂，也可以用82%乙醇，在70～78℃下回流提取。溶剂用量一般为材料的20倍，需多次提取。将植物材料磨碎，经乙醚或石油醚脱脂，拌加碳酸钙，以50%乙醇温浸，浸液合并，于40～45℃减压浓缩至适当体积，用中性乙酸铅去杂蛋白及其他杂质，铅离子可通H2S除去，再浓缩至黏稠状。以甲醇或乙醇温浸，除去不溶物（如无机盐或残留蛋白质等）。醇液经活性炭脱色、浓缩、冷却、滴加乙醚，或置于硫酸干燥器中旋转，析出结晶。单糖或小分子寡糖也可以在提取后，用吸附层析法或离子交换法进行纯化。

（二）多糖的生产

多糖的生产包括提取、纯化、浓度的测定和纯度检查等环节。

1.多糖的提取

提取多糖时，一般先进行脱脂，以便于多糖释放。方法是将材料粉碎，用甲醇或1∶1乙醇-乙醚混合液，加热搅拌1～3 h，也可用石油醚脱脂。动物材料可用丙酮脱脂、脱水处理。

多糖的性质不同，提取方法也不同，主要有以下几种。

（1）稀碱液提取　这一类多糖主要是不溶性胶类，如木聚糖、半乳聚糖等。用冷水浸润材料后用0.5 mol/LNaOH溶液提取，提取液用盐酸中和、浓缩后，加乙醇沉淀得多糖。在稀碱中仍不易溶出者，可加入硼砂，甘露聚糖、半乳聚糖等能形成硼酸配合物多糖，此法可制得相当纯的多糖。

（2）用热水提取　材料用冷水浸过，用热水提取，必要时可加热至80～90℃搅拌提取，提取液用正丁醇与三氯甲烷混合液除去杂蛋白（或用三氯乙酸除杂蛋白），取离心除去杂蛋白后的清液，透析后用乙醇沉淀得多糖。

2.多糖的纯化

多糖的纯化方法很多，但必须根据目的物的性质及条件选择合适的纯化方法。而且往往用一种方法不易得到理想的结果，因此必要时应考虑合用几种方法。

（1）乙醇沉淀法　乙醇沉淀法是制备黏多糖的最常用手段。乙醇的加入改变了溶液的极性，导致糖溶解度下降。供乙醇沉淀的多糖溶液，含多糖的浓度以1%～2%为佳。如使用充分过量的乙醇，黏多糖浓度小于0.1%也可以沉淀完全。向溶液中加入一定浓度的盐（如乙酸钠、乙酸钾、乙酸铵或氯化钠），有助于使黏多糖从溶液中析出，盐的最终浓度为5%即足够。使用乙酸盐的优点是在乙醇中其溶解度更大，即使在乙醇过量时，也不会发生这类盐的共沉淀。一般只要黏多糖浓度不太小，并有足够的盐存在，加入4～5倍乙醇后，黏多糖可完全沉淀。可以使用多次乙醇沉淀法使多糖脱盐，也可以用超滤法或分子筛法（Sephadex G-10或G-15）进行多糖脱盐。加完乙醇，搅拌数小时，以保证多糖完全沉淀。沉淀物可用无水乙醇、丙酮、乙醚脱水，真空干燥，即可得疏松粉末状产品。

（2）分级沉淀法　不同多糖在不同浓度的甲醇、乙醇或丙酮中的溶解度不同，因此可用不同浓度的有机溶剂分级沉淀相对分子质量不同的黏多糖。在Ca2+、Zn2+等二价金属离子的存在下，采用乙醇分级分离黏多糖可以获得最佳效果。

（3）凝胶过滤法　凝胶过滤法根据多糖相对分子质量的不同而进行分离，常用于多糖分离的凝胶有Sephadex G类、Sepharose 6B、Sephacryl S类等。

此外，季铵盐配合法、离子交换层析法、区带电泳法、超滤法及金属配合法等在多糖的分离纯化中也常用到。例如，应用区带电泳法可分离透明质酸、硫酸软骨素与肝素等。

3.溶液中多糖浓度的测定

（1）蒽酮-硫酸比色法测定糖含量。

糖类遇浓硫酸脱水生成糠醛或其衍生物，可与蒽酮试剂结合产生颜色反应，反应后溶液呈蓝绿色，于620 nm波长处有最大吸收，吸光度与糖含量呈线性关系。

标准曲线：准确称取干燥至恒重的葡萄糖10 mg，溶解后置于100 mL容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL标准溶液，置于带塞试管中，加蒸馏水至1 mL。加入2 mg/mL 蒽酮试剂4 mL，混匀，沸水浴10 min。冷却后测定620 nm波长处的吸光度。以零管作为空白对照，以吸光度对葡萄糖浓度作图得标准曲线。

取样品液0.1 mL，按上述步骤操作，测吸光度，以标准曲线计算多糖含量。

（2）3，5-二硝基水杨酸（DNS）比色法测定还原糖。

在碱性溶液中，DNS与还原糖共热后被还原成棕红色氨基化合物，在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系，利用比色法可测定样品中的含糖量。

标准曲线：准确称取干燥至恒重的葡萄糖100 mg，溶解后置于100 mL容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL标准溶液，置于带塞试管中，加蒸馏水至1 mL，分别加入3 mLDNS试剂，沸水浴15 min显色，冷却后用蒸馏水稀释至25 mL，测定550 nm波长处的吸光度。以零管作为空白对照，以吸光度对葡萄糖浓度作图得标准曲线。

取样品液1 mL，按上述步骤操作，测定吸光度，以标准曲线计算多糖含量。

（3）苯酚-硫酸比色法。

苯酚-硫酸试剂可与多糖中的己糖、糖醛酸起显色反应，在490 nm波长处有最大吸收，吸光度与糖含量呈线性关系。

标准曲线：准确称取干燥至恒重的葡萄糖10 mg，溶解后置于100 mL容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.30 mL、0.40 mL、0.50 mL、0.60 mL、0.70 mL、0.80 mL，用蒸馏水补到1.00 mL，振摇混匀。各管再加入5%苯酚溶液1 mL，振摇混匀，迅速加入5.0 mL硫酸，振摇混匀，室温下放置20 min后，在490 nm波长处分别测定吸光度。以葡萄糖溶液的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

吸取样品液0.1 mL，按上述步骤操作，测吸光度，以标准曲线计算多糖含量。

（4）葡萄糖氧化酶法测定葡萄糖。

葡萄糖氧化酶专一性氧化β-葡萄糖，生成葡萄糖酸和过氧化氢，再利用过氧化物酶催化过氧化氢氧化某些物质（如邻甲氧苯胺）使其从无色转变为有色，通过比色法计算葡萄糖含量。葡萄糖溶液中α-葡萄糖和β-葡萄糖存在着动态平衡，随着β-葡萄糖的氧化，最终所有α型全部转变成β型被氧化。此法专一性高、灵敏，适用于测定生成葡萄糖的酶反应。

（5）Nelson法。

还原糖将铜试剂还原生成氧化亚铜，在浓硫酸存在下与砷钼酸生成蓝色溶液，在560 nm波长下的吸光度与糖含量呈线性关系。此方法重复性较好，产物稳定，测定范围为0.01～0.18 mg。

4.纯度检查

多糖的纯度只代表某一多糖的相似链长的平均分布，通常所说的多糖纯品也是指具有一定相对分子质量范围的均一组分。多糖纯度的鉴定通常有以下几种方法：比旋光度法、超离心法、高压电泳法、常压凝胶层析法和高效凝胶渗透色谱法。其中高效凝胶渗透色谱法是目前最常用、较准确的方法，发展较快，而常压凝胶层析法被普遍认为是实验室中最简便的方法。

（1）常压凝胶层析法　常压凝胶层析法是根据在凝胶柱上不同相对分子质量的多糖与洗脱体积成一定关系的特性来进行分离的。凝胶层析的分离过程是在装有多孔物质（交联葡聚糖、多孔硅胶、多孔玻璃等）填料的柱中进行的。选择适宜的凝胶是取得良好分离效果的保证。

（2）高效凝胶渗透色谱法　HPLC法具有快速、分辨率高和重现性好的优点，因此得到越来越多的应用。用于HPLC的凝胶柱均为商品柱，可直接使用。其填料有疏水性的，也有亲水性的，而且每根柱的孔径不同，分离相对分子质量的范围也不同。选用哪一种性质的填料和用多大的排阻限和渗透限，主要取决于被分离溶质的性质和可能的相对分子质量大小。在实际操作中，对于未知相对分子质量的样品，通常是采用分离范围较广的凝胶柱（如Line柱）进行粗分离，确定相对分子质量的大致范围及分离条件，再据此选定合适的凝胶柱进行细分离。为提高柱效和分离度，常将几根孔径不同的柱串联起来，或几根相同的柱串联，以及用一根柱再循环操作。多糖的检测不采用柱后衍生化方法，而是采用直接检测方法。最常用的为示差折光（RI）检测器，具有中等灵敏度。对于酸性多糖，则可以用紫外（UV）检测器，但多数是采用RI和UV检测器同时检测。

（3）比旋光度法　不同的多糖具有不同的比旋光度，在不同浓度的乙醇中具有不同的溶解度。如果多糖的水溶液经不同浓度的乙醇沉淀所得的沉淀物具有相同比旋光度，则该多糖为均一组分。

（4）超离心法　如果多糖在离心作用下形成单一区带，说明多糖微粒沉降速度相同，表明其分子的密度、大小和形状相似。

（三）黏多糖类生化产品的生产

黏多糖是广泛存在于动物体内的复合多糖。它基本上由特定的重复双糖结构构成，在此双糖单位中，包含一个氨基己糖。黏多糖因所含单糖的种类、比例，O-硫酸基等的位置而异，还因所含糖苷键的类型、不同糖苷键的比例以及与此相关的支链程度等而有所不同。并且这些结构因素可能与生理功能的实现有关。随着生物学、生物化学及生化分离技术等的发展，对黏多糖类的理化性质、生理功能、生物活性及药理作用有了更新、更全面的认识，并公认它是一类比较有发展潜力的新型生化药物或生物制品。

1.黏多糖的提取

黏多糖大多与蛋白质以共价键结合，通常先用酶降解蛋白质部分或用碱使多糖与蛋白质间的键裂开，目的是促进黏多糖在提取时的溶解。另外，碱性提取可避免黏多糖中硫酸基团水解而破坏。目前，多采用在碱性提取的同时用蛋白质水解酶来处理组织。

2.黏多糖的分离纯化

一般组织中存在多种黏多糖，因而需要对黏多糖混合物进行分级分离。常用的分离方法有以下几种。

（1）有机溶剂分离法　因为黏多糖有较强的极性，在其水溶液中加入乙醇、丙酮或甲醇等有机溶剂即可产生沉淀，并且不同的黏多糖所含极性基团及相对分子质量不同，产生沉淀所需的乙醇浓度也不同。Meyer等曾将黏多糖溶于5%乙酸钙和0.5 mol/L乙酸缓冲液中，用不同浓度的乙醇溶液分别将硫酸皮肤素（18%～25%乙醇沉淀）、硫酸软骨素A（30%～40%乙醇沉淀）、硫酸软骨素C（40%～45%乙醇沉淀）逐一分开；45%～65%乙醇可将硫酸角质素分离出来。

Lasker和Stivala于1966年按2%乙醇级差由61%至65%浓度递减，将商品肝素分成11种组分，测定各组分的相对分子质量、微分比容、特性黏度及抗凝血活性等，发现其理化特性及生物学特性各不相同。

（2）季铵化合物沉淀法　黏多糖是一类高分子物质，含有大量的酸性基团，并且在溶液中以聚阴离子形式存在，这样就与表面活性剂，如十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）等形成了季铵配合物。而这些配合物在低离子强度的水溶液中不溶解，只有增大离子强度才可解离并溶解。不同多糖的酸性不同，解离所需的临界盐浓度也不同，利用此性质可分离多糖。另外，一般硫酸基含量越高，所需解离的离子强度越大。例如，肝素的临界电解质浓度较高，而只含羧基的透明质酸，其临界电解质浓度最低。

（3）离子交换色谱法　因为黏多糖在溶液中是以聚阴离子的形式存在的，所以可以用阴离子交换剂进行交换吸附。常用的阴离子交换剂有DEAE-纤维素、Dowexl-X2、ECTEOLA-纤维素、TEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等。洗脱时可用氯化钠溶液进行梯度洗脱。

这几种方法都具有成本低、操作简便、适于当前我国生产等优点。

（4）凝胶过滤　Bianchinid等曾经用Sephadex G-50对胰肝素进行色谱分离，得到生物活性（抗补体、部分凝血活素（凝血质）时间活性和凝血酶时间活性）不同的4种成分。Lane用凝胶过滤法得到的高分子肝素（相对分子质量为20000）具有强的部分凝血活素时间活性，但是其X a因子的抑制效应很弱，若长期使用可能引起血小板减少症。而得到的低分子肝素（相对分子质量为5000～6000）的部分凝血活素时间活性虽然很低，但其X a因子抑制效应很强，即使长期用于防治血栓也不易引起出血等副作用。这就说明，对于引起副作用的特殊组分也是可分离的。

（5）亲和色谱　亲和色谱（affinity chromatography）的方法也适用于黏多糖的分离，这是因为黏多糖是一类生物高分子物质，它可与某些对应物质发生专一的可逆结合，如肝素与抗凝血酶Ⅲ（ATⅢ）和脂蛋白脂肪酶有高度亲和性等。Lindahi于1979年将肝素酶解后，得到对ATⅢ有高亲和性的最小片段（12～16糖残基），并且其艾杜糖醛酸含量较高。

（6）等电聚焦　Nader在pH3.0～5.0梯度介质的聚丙烯酰胺凝胶中对肝素酶解液进行等电聚焦（isoelectric focussing），至少可以分出21种组分。将凝胶载体各区带切下洗脱后，测定各组分的相对分子质量和抗凝血活性，发现只有相对分子质量大于7000的组分才具有抗凝性。

随着近代生化分离技术和分析技术的发展，对黏多糖的认识不断深入。而采用高效、可靠的分离技术，并为临床提供具有专一作用、副作用小的组分是完全可行的。

糖类药物的生产方法优化

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