生产L-天冬酰胺酶的优化方法

2023-06-24 理论教育版权反馈

【摘要】：天冬酰胺酶是从大肠杆菌菌体中提取分离的酰氨基水解酶，其商品名为Elspar，可用于治疗白血病。L-天冬酰胺酶呈白色粉末状，微有吸湿性，溶于水，不溶于丙酮、氯仿、乙醚及甲醇。L-天冬酰胺酶对急性粒细胞型白血病和急性单核细胞白血病都有一定疗效，对恶性淋巴瘤也有较好的疗效，对急性淋巴细胞白血病缓解率在50%以上。

一、生产前准备

（一）查找资料，了解L-天冬酰胺酶生产的基本知识

1.结构与性质

L-天冬酰胺酶分子式为C14H17NO4S，相对分子质量为295.35。天冬酰胺酶是从大肠杆菌菌体中提取分离的酰氨基水解酶，其商品名为Elspar，可用于治疗白血病。

L-天冬酰胺酶呈白色粉末状，微有吸湿性，溶于水，不溶于丙酮、氯仿、乙醚及甲醇。冻干品在2～5℃下可稳定存放数月；干品在50℃下持续15 min，酶活力降低30%，60℃下1 h内失活；20%水溶液，室温下储存7 d，5℃下储存14 d均不减少酶活力。最适pH为8.5，最适作用温度为37℃。

2.药理作用与临床应用

L-天冬酰胺酶是抗肿瘤类药物，它能将血清中的L-天冬酰胺水解为天冬氨酸和氨，而天冬酰胺是细胞合成蛋白质及增殖生长所必需的氨基酸。正常细胞有自身合成天冬酰胺的功能，而急性白血病等肿瘤细胞则无此功能，因而当用天冬酰胺酶使天冬酰胺急剧缺失时，肿瘤细胞既不能从血中取得足够天冬酰胺，又不能自身合成，其蛋白质合成受障碍，增殖受抑制，细胞大量破坏而不能生长、存活。L-天冬酰胺酶对急性粒细胞型白血病和急性单核细胞白血病都有一定疗效，对恶性淋巴瘤也有较好的疗效，对急性淋巴细胞白血病缓解率在50%以上。目前多与其他药物合并应用于治疗肿瘤。

（二）确定生产技术、生产菌种和工艺路线

（1）确定生产技术：微生物发酵生产技术。

（2）确定生产菌种：大肠杆菌AS1-375。

（3）确定生产工艺路线：如图1-5-3所示。

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图1-5-3　微生物发酵生产L-天冬酰胺酶工艺流程

二、生产工艺过程及其控制要点

（一）菌种培养

将大肠杆菌AS1-375接种于肉汤培养基，于37℃培养24 h，获得肉汤菌种。

（二）种子培养

按1%～1.5%接种量将肉汤菌种接种于16%玉米浆培养基中，37℃通气搅拌培养4～8 h。

（三）发酵生产

使用玉米浆培养基，接种量为8%，37℃通气搅拌培养6～8 h，得发酵液。

（四）预处理

离心分离发酵液，获菌体，加2倍量丙酮搅拌，压滤，滤饼过筛，自然风干成菌体干粉。

（五）提取、沉淀、热处理

每千克菌体干粉加入0.01 mol/L pH8.3的硼酸缓冲液10 L，37℃保温搅拌1.5 h，降温到30℃以后，用5 mol/L乙酸调节pH至4.2～4.4，进行压滤，滤液中加入2倍体积的丙酮，放置3～4 h，过滤，收集沉淀，自然风干，即得干粗制酶。取粗制酶，加入0.3%甘氨酸溶液，调节pH至8.8，搅拌1.5 h，离心，收集上清液，加热到60℃保温30 min进行热处理后，离心弃去沉淀，上清液中加入2倍体积的丙酮，搅匀，析出沉淀，离心，收集酶沉淀。用0.01 mol/L pH8.0磷酸缓冲液溶解沉淀后，再离心弃去不溶物，收集上清液，即得酶溶液。

（六）精制、冻干

将上述酶溶液调节pH至8.8后，离心收集上清液，将清液再调节pH至7.7，加入50%聚乙二醇，使浓度达到16%。在2～5℃下放置4～5 d，离心得沉淀。用蒸馏水溶解沉淀后，加4倍量的丙酮，沉淀，同法重复1次，沉淀再用0.05 mol/L pH 6.4的磷酸缓冲液溶解，50%聚乙二醇处理，即得无热原的L-天冬酰胺酶。将其溶于0.5 mol/L磷酸缓冲液，在无菌条件下用6号垂熔漏斗过滤，分装，冷冻干燥，制得注射用L-天冬酰胺酶成品，每支1万或2万单位。

（七）L-天冬酰胺酶的检测

1.性状

本品为白色结晶状粉末，无臭，无味。在水中易溶，在乙醇和醚中不溶。

2.鉴别

（1）取本品5 mg，加水1 mL溶解，加20%氢氧化钠溶液5 mL，摇匀，再加1%硫酸铜溶液1滴，摇匀，溶液呈蓝紫色。

（2）取效价测定项下供试品溶液0.1 mL，加0.33%天冬酰胺溶液1.9 mL，37℃水浴反应15 min，取出，加茚三酮约3 mg，加热，显蓝紫色。

3.检查

（1）酸碱度　取本品，加水制成1 mL中含10 mg的溶液，依法测定（《中国药典》2010年版二部附录ⅥH），pH应为6.5～7.5。

（2）溶液的澄清度与颜色　取本品，加水溶液并制成1 mL中含5 mg的溶液，依法测定（《中国药典》2010年版二部附录ⅨA和附录ⅨB），溶液应澄清无色。

（3）纯度　取本品适量，加流动相溶解并制成1 mL约含2 mg的溶液，照分子排阻色谱法（《中国药典》2010年版二部附录VH）测定，按峰面积归一法计算主峰相对含量，不得低于97.0%。

（4）干燥失重　取本品0.1 g，105℃干燥3 h，失重不得超过5.0%（《中国药典》2010年版二部附录ⅧL）。

（5）重金属　取本品0.5 g，依法检查（《中国药典》2010年版二部附录ⅧH第二法），含重金属不得过百万分之二十。

（6）异常毒性　取本品适量，加氯化钠注射液制成1 mL中含4.4万单位的溶液。取体重（20±1）g的雄性小白鼠5只，分别自尾静脉注射0.5 mL，给药后30 min内不得出现呼吸困难、抽搐症状。

（7）降压物质　取本品适量，依法检查（《中国药典》2010年版二部附录Ⅺ G），剂量按猫体重每千克注射1万单位，应符合规定。

（8）细菌内毒素　取本品适量，依法检查（《中国药典》2010年版二部附录ⅪE），每单位天冬酰胺酶中含内毒素的量应小于0.015 EU。

4.效价测定

（1）酶活力测定。

①对照品溶液的制备　取105℃干燥至恒重的硫酸铵适量，精密称定，加水溶解并定量稀释，制成0.0015 mol/L的溶液。

②供试品溶液的制备　取本品约0.1 g，精密称定，加入pH为8.0的磷酸盐缓冲液（取0.1 mol/L磷酸氢二钠溶液适量，用0.1 mol/L磷酸二氢钠溶液调节pH至8.0）溶解并定量稀释成1 mL约含天冬酰胺酶5单位的溶液。

测定方法：取试管3支（φ1.2 cm×14 cm），分别加入用上述磷酸盐缓冲液配制的0.33%天冬酰胺溶液1.9 mL，于37℃水浴中预热3 min，分别于第1管（t0）加入25%三氯乙酸溶液0.5 mL，第2、3管（t）各精密加入供试品溶液0.1 mL，置37℃水浴中，准确反应15 min，立即于第1管（t0）精密加入供试品溶液0.1 mL，第2、3管（t）各加入25%三氯乙酸溶液0.5 mL，摇匀，分别作为空白反应液（t0）和反应液（t）。精密量取t0、t和对照品溶液各0.5 mL置于试管中，每份平行做2管，各加水7.0 mL及碘化汞钾溶液（取碘化汞23 g、碘化钾16 g，加水至100 mL，临用前用20%氢氧化钠溶液等体积混合）1.0 mL，混匀；另取试管一支，加水7.5 mL及碘化汞钾溶液1.0 mL，作为空白对照管，室温放置15 min，用紫外-可见分光光度法（《中国药典》2010年版二部附录Ⅳ A），在450 nm波长处，分别测定吸收度A0、At和As（对照品），以At的平均值，按下式计算：

式中：5为反应常数；F为对照品溶液浓度的校正值。

效价单位的定义：在上述条件下，一个L-天冬酰胺酶单位相当于每分钟分解L-天冬酰胺产生1μmol氨所需的酶量。

（2）蛋白质含量。

取本品约20 mg，精密称定，依照氮测定法（《中国药典》2010年版二部附录ⅦM第一法）测定，即得。

生产L-天冬酰胺酶的优化方法

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