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2023-12-05
溶菌酶：生产、作用及应用价值
【摘要】：人体内的溶菌酶常与激素或维生素结合，以复合物的形式存在。人溶菌酶的溶菌活性比鸡蛋清溶菌酶高3倍。因此，溶菌酶具有抗菌消炎的作用，并能保护机体不受感染。药用溶菌酶与抗生素合用具有良好的协同作用，可增强疗效，常用于难治的感染病症。溶菌酶内服能阻止流感和腺病毒繁殖。溶菌酶作为机体非特异免疫因子之一，参与机体多种免疫反应，在机体正常防御功能和非特异免疫中，具有保持机体生理平衡的重要作用。
一、生产前准备
（一）查找资料，了解溶菌酶生产的基本知识
1.结构和性质
溶菌酶（lysozyme，LZM，EC3.2.1.17）又称细胞壁质酶（muramidase）或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶（N-acetyl muramide glycanohydralase）。溶菌酶是小分子蛋白酶，相对分子质量约1.4×104，由129个氨基酸组成，是一种碱性蛋白质，是能分解革兰氏阳性菌细胞壁缩氨酸聚糖分子中β-1，4-糖苷键的一组酶的总称，广泛存在于人体心、肝、脾、肺、肾等多种组织中，以肺与肾中含量最高。鸟类和家禽的蛋清，哺乳动物的泪、唾液、血浆、尿、乳汁等体液以及微生物中也含此酶，其中以蛋清中含量最为丰富。人体内的溶菌酶常与激素或维生素结合，以复合物的形式存在。该酶由粒细胞和单核细胞持续合成与分泌，对革兰氏阳性菌有较强杀灭作用。因此，被认为是人体非特异性免疫中的一种重要的体液免疫因子。
（1）鸡蛋清溶菌酶。
鸡蛋清溶菌酶占蛋清总蛋白的3.4%～3.5%，作为溶菌酶类的典型代表，是目前重点研究的对象，也是了解得最清楚的溶菌酶之一。它可分解溶壁微球菌、巨大芽孢杆菌、黄色八叠球菌等革兰氏阳性菌。
鸡蛋清溶菌酶由18种129个氨基酸残基构成单一肽链，富含碱性氨基酸，有4对二硫键维持酶构型，是一种碱性蛋白质。其N末端为赖氨酸，C末端为亮氨酸。鸡蛋清溶菌酶的相对分子质量为14000～15000。最适pH为6.6，pI为10.5～11.0。
该酶非常稳定，耐热，耐干燥，室温下可长期保存。吡啶、盐酸胍、尿素、十二烷基磺酸钠等对酶有抑制作用，但酶对变性剂相对不敏感。
（2）哺乳动物的溶菌酶。
哺乳动物的溶菌酶与鸡蛋清溶菌酶的性质类似，空间结构也十分相似。人溶菌酶由130个氨基酸残基组成，相对分子质量为14600，存在于眼泪、唾液、鼻黏液、乳汁等分泌液以及淋巴结和白细胞中。人溶菌酶的溶菌活性比鸡蛋清溶菌酶高3倍。猪的溶菌酶主要集中在肝线粒体中，对脂溶性物质极不稳定，分离时易导致酶失活。
（3）药用溶菌酶。
药用溶菌酶为白色或微黄色的结晶性或无定形粉末；无臭，味甜；易溶于水，在水溶液中遇碱易破坏。难溶于丙酮或乙醚。
2.药理作用与临床应用
溶菌酶具有多种生化功能，包括非特异性的防御感染免疫反应、血凝作用、间隙连接组织的修复、参与多糖的生物合成以及抗菌作用等。
（1）抗菌消炎。
溶菌酶能有效地水解细菌细胞壁的肽聚糖，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂，内容物逸出而使细菌溶解。它能阻碍致病细菌的活性繁殖，并杀死致病菌。因此，溶菌酶具有抗菌消炎的作用，并能保护机体不受感染。它还能分解黏厚的黏蛋白，消除黏膜炎症，分解黏脓液，促进黏多糖代谢及清洁上呼吸道。临床上主要用于五官科多种黏膜疾患，如治疗慢性副鼻窦炎及口腔炎等。也用于慢性支气管炎的去痰、鼻漏及耳漏等脓液的排出。
药用溶菌酶与抗生素合用具有良好的协同作用，可增强疗效，常用于难治的感染病症。它能影响消化道细菌对皮层的渗透力，用于治疗溃疡性结肠炎。也可分解突变链球菌的病原菌，用于预防龋齿。还用于治疗咽喉炎、扁平苔藓。对好氧细菌性死物寄生菌引起的炎症也有效。
（2）抗病毒。
溶菌酶能与带负电荷的病毒蛋白直接作用，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。该酶也可以预防和治疗病毒性肝炎，尤其对输血后肝炎及急性肝炎的效果较为显著。在机体内它还有抗流感病毒的活性，它与胆酸盐的复合物能强烈抑制流感病毒和腺病毒的生长，并能防止疱疹性病毒感染，因而具有抗病毒作用。溶菌酶内服能阻止流感和腺病毒繁殖。
（3）参与机体多种免疫反应，增强免疫力。
溶菌酶作为机体非特异免疫因子之一，参与机体多种免疫反应，在机体正常防御功能和非特异免疫中，具有保持机体生理平衡的重要作用。它可改善和增强巨噬细胞吞噬和消化功能，激活白细胞吞噬功能，并能改善细胞抑制剂所导致的白细胞减少，从而增强机体的抵抗力。溶菌酶本身具有T淋巴细胞表位，能诱导2型（Th2）辅助T淋巴细胞反应，口服溶菌酶能诱导小鼠产生全身性的Th1和Th2免疫反应，增强免疫功能，因此，口服溶菌酶可控制上呼吸道感染并能治疗痢疾。
（4）止血、消肿。
溶菌酶还具有激活血小板的功能，可以改善组织局部血液循环障碍，分泌脓液，增强局部防卫功能，从而体现其止血、消肿等作用。
（5）其他药理作用。
溶菌酶可以作为一种宿主抵抗因子，对组织局部起保护作用，从而增强组织恢复功能；溶菌酶在婴儿体内可以直接或间接促进婴儿肠道细菌双歧乳酸杆菌的增殖，促进婴儿消化吸收，促进人工喂养婴儿肠道细菌的正常化；能够加强血清灭菌蛋白（properdin）、γ-球蛋白（γ-globulin）等体内防御因子对感染的抵抗力，特别对早产婴儿有防御体重减轻、预防消化器官疾病、增进体重等功效。
（二）确定生产技术、生产原料和工艺路线
（2）确定生产原料：蛋清。
（3）确定生产工艺路线：如图1-5-1所示。
图1-5-1 从蛋清中提取溶菌酶的工艺流程
二、生产过程
（一）原料预处理
取新鲜或冷冻蛋清（让其自然熔化），用试纸测pH应为8.0左右，过铜筛，除去蛋壳碎片、脐带等杂物。
（二）吸附
将上述处理过的蛋清降温至5℃左右，边搅拌边加入已处理好的724树脂（pH6.5，按蛋清量的14%左右加入），使树脂全部悬浮在蛋清中，保持在5℃下，搅拌吸附5 h，低温静置过夜，分层。
（三）去杂蛋白
将上清液慢慢倾出弃去，下层树脂用清水反复洗几次，以除去杂蛋白，最后抽滤除去树脂的水分。再向树脂中加入等体积pH6.5、0.15 mol/L磷酸钠缓冲液，搅拌洗脱20 min，减压抽滤除去洗脱液（含杂质），反复3次。
（四）洗脱
向除去杂物的树脂中加入等量浓度为10%的硫酸铵溶液，搅拌洗脱30 min，滤出洗脱液，重复洗脱树脂3次，过滤抽干，合并洗脱液。
（五）沉淀
按洗脱液总量加入32%（质量比）固体硫酸铵粉末，搅拌使其完全溶解，有白色沉淀产生，冷处放置过夜，虹吸弃去上清液，沉淀离心分离或减压抽滤，得粗制品。
（六）透析
将粗制品用蒸馏水全部溶解，装入透析袋中，在10℃水中透析过夜，除去大部分硫酸铵，收集澄清透析液。
（七）盐析
向澄清的透析液慢慢滴加4%的氢氧化钠溶液，同时不断搅拌，调节pH至8.5～9.0，如有白色沉淀，应立即离心除去。然后边加入3 mol/L盐酸调节pH至3.5，边按体积缓慢加入5%的固体氯化钠，搅拌均匀即有白色沉淀析出。0～5℃静置48 h左右，离心或减压过滤，收取溶菌酶盐析物。
（八）干燥
将沉淀的盐析物加入10倍量的冷却至0℃的无水丙酮中，不断搅拌，使颗粒松散，冷处放置数小时，滤除丙酮，沉淀经真空干燥即得溶菌酶产品。（如不用丙酮脱水，也可将盐析物用蒸馏水溶解后再透析，其透析液冷冻干燥，得不含氯化钠的溶菌酶制品。）
（九）制剂
取干燥粉碎的糖粉，加入总量为5%的滑石粉，过120目筛，加适量5%淀粉浆，在搅拌机内混合搅拌均匀，制成软料，12目筛制颗粒，55℃烘干，用14目筛整理颗粒，控制水分在2%～4%，再按计算量加入溶菌酶粉混合，加1%硬脂酸镁，过16目筛2次，压片机压制成口含片，每片含溶菌酶20 mg。也可以根据需要制成肠溶片、膜剂及眼药水滴剂等。
（十）质量检测
1.质量检查
卫生部药品标准规定：药用溶菌酶为含氯化钠的结晶或无定形粉末。
（1）性状。
本品为白色或微黄色的结晶性或无定形粉末；无臭，味甜；易溶于水，不溶于丙酮、乙醚。水溶液遇碱易破坏。
（2）鉴别。
①取本品约2 mg，加水2滴使其溶解，加10%氢氧化钠溶液5滴与10%硫酸铜溶液1滴，混匀后显紫红色。
②取本品，加乙酸-乙酸钠缓冲液（取无水乙酸钠6.7 g，加水约900 mL，振摇使其溶解，用乙酸调节pH至5.4，加水稀释至1000 mL，摇匀）制成1 mL中含溶菌酶0.4 mg的溶液，用分光光度法（《中国药典》2010年版二部附录ⅣA）测定，在280 nm波长处有最大吸收峰，吸光度应为0.39～0.49。
（3）检查。
①酸度 取本品0.1 g，加水至10 mL溶解后，依法测定（《中国药典》2010年版二部附录ⅥH），pH应为3.5～6.5。
②干燥失重 取本品0.2 g，置于五氧化二磷干燥器中，减压干燥3 h，失重不得过5.0%（《中国药典》2010年版二部附录ⅧL）。
③总氮量 取本品，用氮测定法（《中国药典》2010年版二部附录ⅦD），按干燥品计算，含总氮量应为15.0%～17.0%。
2.效价测定
卫生部药品标准规定：药用溶菌酶按干燥品计算，1 mg的效价不得少于6250单位。
（1）供试品溶液的制备 取本品约25 mg，精密称定，置于25 mL容量瓶中，加磷酸盐缓冲液（取磷酸二氢钠10.4 g与磷酸氢二钠7.86 g及乙二胺四乙酸二钠0.37 g，加水溶解并稀释至1000 mL，调节pH至6.2）适量使其溶解，并稀释成1 mL中含溶菌酶50 μg的溶液。
（2）底物悬液的制备 称取溶酶小球菌15～20 mg，加磷酸盐缓冲液（pH6.2）0.5～1 mL，在研钵内研磨3 min，再加磷酸盐缓冲液（pH6.2）适量，使总体积约为50 mL，将悬液于（25±0.1）℃下，在450 nm波长处测得的吸光度为0.70±0.05。（悬液临用前配制。）
（3）测定法 精密量取（25±0.1）℃的底物悬液3 mL，置于1 cm比色皿中，在450 nm波长处测定吸光度，作为零秒的读数A0，然后精密量取（25±0.1）℃的供试品溶液0.15 mL（相当于溶菌酶7.5μg），加到上述比色皿中，迅速混匀，用秒表计时，至60 s时再测定吸光度A；同时精密量取磷酸盐缓冲液（pH6.2）0.15 mL，同法操作，作为空白试验，测得零秒的读数
及60 s的读数A'。按下式计算：
式中，m为测定液中供试品的质量，μg。
效价单位的定义为：在25℃、pH6.2时，在450 nm波长处，每分钟引起吸光度下降0.001为一个酶活力单位。
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