酶类药物的生产技术及关键环节

（一）酶类药物的生产技术

酶类药物的生产技术主要有直接提取酶技术、微生物发酵产酶技术和动植物细胞培养产酶技术。

1.直接提取酶技术

直接提取酶技术又称生化制备技术，即从符合要求的含酶生物材料中制取酶的方法。一般包括四个步骤：酶原材料的选择和预处理、酶的提取、酶的纯化、酶活力的测定和纯度检测。

（1）酶原材料的选取。

酶原材料的选取应遵循材料来源广、目的酶含量高、价格低廉、容易制取等原则。动物酶常取肝、肾、心肌、血液、胃液、尿液、乳汁、胃肠黏膜、腿股肌等，很多都是取自动物产品加工的新鲜下脚料；植物酶则尽量用加工废弃物，如果皮、米糠、生榨油的饼粕、非食用种子等。尽可能设计综合利用材料的联产工艺路线，以取得最大的经济效益。例如，从胰脏中提取胰岛素、弹性蛋白酶、激肽释放酶，从猪或牛血中同时提取超氧化物歧化酶、凝血酶等。

取材应注意时宜。动物酶含量因动物年龄、性别不同而有差别。例如，乳糖酶在大多数人类的哺乳期肠道中存在，哺乳期之后酶基因可能已关闭了。植物酶的合成速度常因植物的生长发育阶段不同而有明显变化，一般应当在目的酶合成高峰后期及时取材。一般来说，种子萌发阶段，某些分解代谢的酶大量合成，或是由无活性态转变为活性态；开花到种子成熟阶段，某些合成代谢的酶大量合成，活力增强。例如：大麦发芽时，α-淀粉酶开始大量合成，R酶、β-淀粉酶大部分转为活性态；大豆发芽时，植酸酶含量上升；高淀粉植物（如薯芋类植物），在它们的块根或块茎迅速膨大阶段，淀粉合成酶的含量很高，活性很强。对动物要在经过一段时间饥饿之后再取材，这样可减少糖和脂肪的摄入，以利于酶的提取。

新鲜材料应即时提取酶，取材量大而来不及在短时间内处理的，一般要低温或冷冻（-50～-10℃）保存，并加酶的保护剂，以降低酶的分解速度。

（2）原材料的预处理。

胞外酶可以直接提取分离，而对胞内酶，一般应根据各种生物组织的细胞特点、性质和处理量，选用适当的方法破碎组织细胞，使酶从其中释放出来，以利于提取。常用的原材料预处理的方法有下面几种。

①机械法　利用机械剪切力破碎细胞。一般先用绞肉机将材料破碎成组织糜后匀浆。在实验室常用的是组织捣碎机、匀浆器、研钵和研磨等。工业上则用高压匀浆泵或高速珠磨机。高压匀浆泵处理容量大，适合于细菌和大多数真菌的细胞破碎，也可用于动物组织的预处理，但不适用于丝状微生物细胞的破碎。高速珠磨机具破碎和冷却双重功能，破碎效率高，对真菌菌丝和藻类的破碎效果也较好，但操作参数多。

②冻融法　将材料冷冻到-10℃左右，再缓慢溶解至室温，反复多次而达到破壁作用，从而使酶释放出来。冷冻一方面能使细胞膜的疏水键结构破裂，从而增加细胞的亲水性能，另一方面在细胞内形成冰粒，剩余细胞液的盐浓度增高，引起细胞突然膨胀而破裂。多用于动物性材料，对于细胞壁较脆弱的菌体，也可采用此法。

③酶解法　利用微生物本身产生的酶进行组织自溶或利用溶菌酶、蛋白水解酶、糖苷酶、脱氧核糖核酸酶、磷脂酶等外源性的酶对细胞膜或细胞壁的降解作用使细胞崩解破碎。微生物发酵生产胞内酶时，可用自溶法大规模操作，植物细胞用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶混合酶去壁，效果显著。酶解法常与冻融法等破碎方法联合使用。

④丙酮粉法　用丙酮将组织细胞迅速脱水干燥制成丙酮粉，不仅可减少酶变性，而且可因细胞结构成分的破坏使酶蛋白与脂质结合的某些化学键断开，从而促使某些结合酶释放至溶液中。常用方法是将匀浆（或组织糜）悬浮于0.01 mol/L pH6.5的磷酸盐缓冲液中，于0℃下边搅拌边慢慢加入5～10倍体积的-15℃无水丙酮中，静置10 min，离心过滤，取其沉淀物，用冷丙酮反复洗数次，真空干燥，即得含酶丙酮粉。丙酮粉在低温下可保存数年。

2.微生物发酵产酶技术

微生物发酵产酶法是指选育优良的酶生产菌，采用适宜的发酵工艺，提供适当的营养和生长环境，使生产菌大量增殖，同时合成所需要的酶，再进行提取分离纯化，获得目的酶。其工艺过程与其他发酵产品相似，包括优良菌种的选育、发酵工艺过程及条件控制、酶产品的提取分离纯化。微生物发酵产酶法的技术关键如下。

（1）高产菌株的选育。

优良菌种的选育是提高酶产量的关键，筛选符合生产需要的菌种是发酵生产酶的首要环节。一个优良的产酶菌种应具备以下特点：产酶量高、繁殖快、生产周期短；能利用廉价原料，容易培养和管理；产酶性能稳定，菌株不易退化；不易受噬菌体侵袭；产生的酶容易分离纯化；安全可靠、无毒性，既不是致病菌，在系统发生上也与病原体无关，不产毒素。

高产菌株可从以下三种途径中获得：从自然界分离筛选；用物理或化学的方法诱变育种；用基因重组与细胞融合技术育种。

（2）发酵工艺的优化。

获得了酶的高产菌株，还必须探索产酶的最适培养基、培养条件（如培养温度、pH和通气量等），才能发挥菌株的最大产酶性能。工业生产中还应摸索出一系列发酵和提取分离纯化工程和工艺条件，并进行严格的过程控制，以获得最佳的综合效果，取得良好的经济效益。

（3）发酵方法。

微生物发酵产酶的主要方式有固体发酵法、液体深层发酵法和固定化细胞或固定化原生质体发酵法。

①固体发酵法　以麸皮、米糠等为主要原料，加入其他必要的营养成分，制成固体或半固体的麸曲，经灭菌、冷却后，加入产酶菌株，在一定条件下进行发酵。固体发酵法主要用于真菌的酶生产，其中用米曲霉生产淀粉酶，以及用曲霉和毛霉生产蛋白酶在我国已有悠久历史。该法所需设备简单，操作方便，麸曲中酶浓度较高，特别适用于各种霉菌的培养和发酵产酶。中等规模的固体发酵生产投资少，成本低，但劳动强度较大，原料利用率较低，固体发酵条件控制不易均匀，生产周期较长。

②液体深层发酵法　将液体培养基置于发酵容器中，经灭菌、冷却后接入产酶细胞，在一定条件下进行发酵。液体深层发酵法是采用液体培养基，置于具有搅拌桨叶和通气系统的密闭发酵罐中，经灭菌、冷却后接入产酶菌株，借强大的无菌空气或自吸的气流进行充分搅拌，使气液接触面积尽量加大而进行发酵。液体深层发酵是目前酶发酵生产的主要方式。其主要特点是机械化程度较高，技术管理较严，培养条件容易人为控制，不易染杂菌，酶产率高、质量好，产品回收率较高，生产效率高。不仅适用于微生物细胞，也可用于各种植物细胞和动物细胞的悬浮培养和发酵。液体深层发酵法是现代酶制剂大规模生产的主要方式。

③固定化细胞或固定化原生质体发酵法　将产酶微生物细胞或原生质体固定在水不溶性载体上，在一定的空间范围内进行生命活动（生长、繁殖和新陈代谢）而产酶。固定化细胞或固定化原生质体的密度较高，反应器水平的生产强度较大，可提高生产能力；发酵稳定性好，可反复使用或连续使用较长的时间，易于连续化、自动化生产；细胞固定在载体上，流失较少，可在高稀释率的情况下连续发酵，大大提高设备利用率；发酵液中含菌体较少，利于产品分离纯化，产品质量高。但该法技术要求较高，需要特殊的固定化细胞反应器，只适用于胞外酶的生产。

（4）影响产酶的条件及其控制。

①温度　发酵温度既影响微生物的生长繁殖和产酶，也影响酶的稳定性。不同微生物生长繁殖和产酶，对温度的要求不同。发酵产酶的微生物，大多数在30～40℃大量增殖，但是，生长繁殖的最适温度往往与酶合成的最适温度不一致。多数生产菌要求生长期的温度高于产酶期，例如，酱油曲霉生长温度为40℃，产蛋白酶的温度为28℃；有的生产菌则相反，产酶期温度高于生长期，例如，根霉生长期要求30℃，产酶期以35℃为宜；有的菌种，生长和产酶温度一致，例如，链霉菌产葡萄糖异构酶，一直保持32℃即可。发酵过程的温度控制应满足生产菌种的要求。一般初期需要保温，至菌体大量增长时，因微生物产生的呼吸热释放出来，发酵罐温度上升较快，这时必须降温，到酶合成阶段，则要根据产酶对温度的要求进行控制。

②pH　不同的微生物，生长繁殖的最适pH不同。一般来说，细菌和放线菌要求中性或微碱性（pH6.5～8.0），霉菌要求偏酸性（pH4.0～6.0）。而对于酶合成的适宜pH，大多数生产菌要求在该酶的催化反应最适pH条件下进行。培养基pH不仅影响微生物的生长和产酶，而且对酶的分泌也有作用。有些细胞可以同时产生多种酶，通过控制培养基的pH，往往可以改变各种酶之间的产量比例。pH的调节可以通过改变培养基的组分或其比例来实现。必要时可使用缓冲液，发酵过程中可以根据pH的变化情况，流加适量的酸、碱溶液，当pH上升很快时，加糖或淀粉，下降很快时，加尿素或液氨，使pH保持在适宜的范围内，以利于微生物发酵产酶。

③溶氧与通风搅拌　酶蛋白质的生物合成要消耗大量ATP，只有有氧呼吸才能满足这个需求。因此，酶制剂的发酵生产是需氧发酵，且不同的微生物对氧的要求不一样。发酵过程中的溶氧是由供气系统制备的无菌压缩空气中的氧溶解在培养基中而获得的。控制发酵过程的供氧量，主要手段是改变通气量，此外，在特定情况下，还需要在通入的空气中掺入纯氧，才能满足发酵高峰期的耗氧需求。提高发酵罐的罐压可以提高发酵液中的氧饱和度，也能在一定范围内提高供氧能力。在通用型通风搅拌发酵罐中发酵时，通过搅拌装置的搅拌，打碎进入罐体发酵液中的空气气泡，可以大大增加气体与液体的接触面积，从而加快溶氧速率；搅拌还可以使发酵液中的菌体分散均匀，更充分地与溶液接触，以利用氧。近年来发现，十一烷至十七烷的混合物、全氟化碳等有很强的溶氧力，本身不溶于水，被称为氧载体。在发酵液中加入适量氧载体，可以使氧的传递速率提高数倍。更新颖的是，将透明颤菌血红蛋白（Vitreoscilla hemoglobin，VHb）基因克隆到生产菌基因组中，提高菌体自身的载氧能力，称为生物工程溶氧。

④泡沫和消泡剂　在发酵过程中，由于搅拌等，会产生较多的泡沫，使微生物呼出的CO2不易排除，氧与液体的接触面减小，溶氧速率下降；泡沫过多时，还会在较高的罐压下外溢，往往引起杂菌污染，危害性很大。因此，必须采取消泡措施，进行有效控制，生产上多用滴加消泡剂，如植物油、矿物油、“泡敌”（聚环氧丙烷或乙烷甘油醚）、甘油聚醚（聚氧丙烯甘油醚）、聚二甲基硅氧烷等进行消泡。

⑤添加产酶促进剂和生长因子　产酶促进剂是少量加入之后能显著增加酶产量的物质，一般是酶的诱导物或表面活性剂。例如，纤维素能诱导纤维素酶，吐温-80可提高多种酶的产量。生产上提高胞外酶的活力，一般采用非离子型表面活性剂。

酶生产时需要供给微生物生长所需的氨基酸、维生素、嘌呤碱和嘧啶碱等生长因子。一般通过加入玉米浆、酵母膏、麸皮、米糠，以及豆饼等提供。例如，添加含有生长因子的大豆酒精提取物，可使米曲酶的蛋白酶产量提高1.9倍。

3.动植物细胞培养产酶技术

与微生物细胞相比，动植物细胞大几倍至数十倍，倍增时间长几倍至几十倍，培养周期长，对培养基的要求高，培养过程需要供氧，却又不耐搅拌等剪切力强的操作条件，尤其是动物细胞无壁，对剪切力更敏感。动物细胞属于异养型细胞，很多营养成分不能自己合成，因而对培养基成分要求苛刻，往往必须加血清或其代用品；大多数动物细胞，有附壁生长（黏附于某种固体物上生长）的特点，因而要实现大规模培养更加困难。动植物细胞培养产酶要点如下。

（1）植物细胞组织培养产酶的工艺特点。

植物细胞组织培养有固体培养和液体培养两大类。培养方式有分批式、半连续式和连续式。植物细胞组织培养的主要工艺特点如下。

①培养基　植物细胞组织培养中，常用Murashige-Skoog（MS）培养基和Gamborg's B5（B5）培养基，由碳源、氮源、大量元素、微量元素、维生素和植物激素5类组分合成。

②培养温度和pH　一般植物细胞组织培养的适宜温度在20～25℃，酶合成温度因植物种类而异，总体上，温度一般控制在室温范围；植物细胞组织培养要求稳定的pH，一般在微酸性范围内，pH最好控制在5.8～6.1。

③通气与搅拌　植物细胞组织培养需要一定量的溶氧，因而需要通气和搅拌。但是和微生物相比，植物细胞代谢较慢，耗氧速率也较小，加之细胞比较大，对剪切力敏感，所以通气和搅拌不能太剧烈。

④添加刺激物（促进物）和前体　在植物酶的合成时期，添加适当的刺激物（促进物），如微生物细胞壁碎片、微生物胞外酶等，可以提高酶合成量。例如花生细胞合成苯丙氨酸氨裂合酶时，添加霉菌细胞壁碎片，可使酶合成量提高20倍。光照对一些植物酶有诱导作用或抑制作用。前体的添加可提高次级代谢物的产量，从而提高产酶量。

（2）动物细胞培养产酶的工艺特点。

动物细胞培养生产疫苗、细胞生长因子等，技术上已很成熟。动物细胞的培养有悬浮培养法和固体或半固体培养法。前者用以培养来自血液的细胞、淋巴组织细胞等；后者用以培养来自动物复杂器官中的细胞，由于这些细胞与周围细胞互相依存，即所谓“定位依存”，因此，它们必须依附于固体或半固体的表面才能正常代谢，这就是动物细胞的附壁生长特性。

①培养基　通常以葡萄糖为碳源；各种盐类的阳离子总数必须与阴离子总数相等，溶液的渗透压必须与细胞内的渗透压相等，即是等渗溶液；添加血清或其代用品来提供必需氨基酸、必需脂肪酸、维生素、动物激素、一些动物细胞的生长因子等，确定各种必需氨基酸、脂肪酸等的配比时，既要考虑相互之间的关系，还要注意离子间的平衡和等渗等要求。

②培养条件控制　动物细胞对温度控制的要求很严，温度的波动范围只能在±0.25℃；pH常用NaHCO3来调节；溶氧条件调节，常用纯氧、氮、二氧化碳和空气四种气体的不同比例进行，不直接通气，更不搅拌；要严格控制渗透压。

动植物细胞培养产酶结束后，收取培养物，用酶提取缓冲液洗涤除去材料表面附着的培养基，然后加适量的提取缓冲液，匀浆破碎细胞，离心，收集酶液，再分离纯化。

（二）酶类药物的提取

酶类药物的提取方法主要有水溶液法、有机溶剂法和表面活性剂法三种，应根据酶的溶解性质、稳定性及其影响因素、酶与其他物质结合的性质等选择适宜的方法。

（1）水溶液法　用低浓度或等渗的盐溶液或缓冲液提取。胞外酶和经过预处理的原料，包括组织糜、匀浆、细胞颗粒以及丙酮粉等中的游离的酶，都可用水溶液抽提。用水溶液抽提酶时，应首先考虑温度，以保持酶的稳定性，防止提取过程中酶活力降低，并有较高的酶溶解度。因此，提取时一般在低温下进行，但对温度耐受性较高的酶应提高温度。例如：提取胃蛋白酶时，为了水解黏膜蛋白，需在40℃左右水解2～3 h提取；超氧化物歧化酶的提取则可加热到60℃左右使杂蛋白变性，以利于酶的提取与纯化。提取溶剂的pH也要适宜，其选择原则如下：在酶稳定的pH范围内，选择偏离等电点的适当pH，酸性蛋白酶用碱性溶液提取，碱性蛋白酶用酸性溶液提取。

（2）有机溶剂法　某些结合酶（如结合在微粒体膜和线粒体膜上的酶），由于和脂质结合牢固，难以用水溶液提取，必须用有机溶剂除去结合的脂质，且不能使酶变性。最常用的有机溶剂是正丁醇。正丁醇亲脂性强，特别是亲磷脂性强，且兼具亲水性，在0℃仍有较好的溶解度，在脂与水分子间能起类似去垢剂的桥梁作用。丁醇提取法有两种：一种称为均相法，向组织匀浆中加入丁醇搅拌后即成均相，然后离心，取下层液相层，该法丁醇用量小，但抽提时间较长，且许多酶在与脂质分离后极不稳定，需加注意；另一种称为二相法，在每克组织或菌体的干粉中加5 mL丁醇，搅拌20 min，离心，取沉淀，然后用丙酮洗去沉淀上的丁醇，再在真空中除去溶剂，所得干粉可进一步用水提取。该法适用于易在水溶液中变性的材料。

（3）表面活性剂法　表面活性剂有亲水性和疏水性的功能基团，分为阴离子型（如脂肪酸盐、烷基苯磺酸盐及胆酸盐等）、阳离子型（如十八烷基二甲基苄基氯化铵等）和非离子型（如Triton类、吐温-60等）。表面活性剂能和酶结合并使之分散在溶液中，因此可用于提取酶。其中，非离子型表面活性剂比离子型的温和，不易引起酶失活，故使用较多。

（三）酶类药物的纯化

不同的酶，由于性质的差异，其纯化工艺有很大差别。评价一个纯化工艺是否恰当，主要看两个指标：比活力（纯度）和总活力回收率。一个好的纯化工艺应是比活力（纯度）提高多，总活力回收率高，而且重现性好。

目前，国内外纯化酶的方法很多，且基本上都是根据酶与杂质在下列性质上的差异建立的：①根据溶解度的不同，包括盐析法、有机溶剂沉淀法、共沉淀及选择性沉淀法等；②利用稳定性的差异，如选择性热变性法、选择性酸碱变性法和选择性表面变性法；③根据解离特性，如离子交换层析法、电泳法、等电聚焦法等；④利用分子大小的不同，如凝胶过滤（层析）法、超滤法及超速离心法等；⑤根据酶和底物、底物类似物、辅助因子及抑制剂间具有专一性作用的特点，如亲和层析法。一种酶的纯化往往要选择几种方法，按一定的程序使用上述方法，以达到一定的纯化目标。

1.杂质的去除

在酶的提取液中，除了含有待纯化的酶外，还含有各种蛋白质、多糖、脂类和核酸等大分子杂质和一些小分子杂质。大分子杂质的去除是纯化的主要工作，去除的主要方法如下。

（1）调节pH和加热沉淀法　利用蛋白质酸碱变性性质的差异，通过调节pH和等电点除去某些杂蛋白，也可利用不同蛋白质热稳定性的不同，将酶液加热到一定温度，使杂蛋白变性而沉淀。例如，胰蛋白酶、胰核糖核酸酶、溶菌酶等耐高温的酶在酸性条件下可加热到90℃不被破坏，而大量杂蛋白则变性沉淀而离开酶所在的溶液体系。

（2）蛋白质表面变性法　利用蛋白质表面变性性质的差异去除杂蛋白。例如制备过氧化氢酶时，向酶抽提液中加入氯仿和乙醇混合振荡，造成选择性表面变性来制备。振荡处理后通常分为三层，乳浊状变性杂蛋白分布于中层而去除。

（3）选择性变性法　利用不同的蛋白质对变性剂的稳定性差异，可以选择某种变性剂。例如，胰蛋白酶、细胞色素c等对三氯乙酸较稳定，可用2.5%三氯乙酸使几乎所有的杂蛋白变性沉淀除去。

（4）加保护剂的热变性法　利用底物、底物类似物、辅酶、竞争性抑制剂和酶结合后酶的稳定性大大提高的特点，用底物等作为保护剂，再用加热的手段除去杂蛋白。例如，D-氨基酸氧化酶加抑制剂O-甲基苯甲酸后耐热性显著上升。

（5）核酸沉淀或降解法　用微生物等为原料的抽提液中常含有大量核酸，可加硫酸链霉素、聚乙烯亚胺、三甲基十六烷基溴化铵、鱼精蛋白和二氯化锰等沉淀剂使之沉淀除去。也可用核酸酶将核酸降解成核苷酸后离心分离除去。黏多糖则常用乙酸铅、乙醇、单宁酸和离子型表面活性剂等处理后除去。

2.脱盐和浓缩

（1）脱盐。

粗酶常常需要脱盐，最常用的方法是透析和凝胶过滤。

①透析　透析可除去酶液中的盐类、有机溶剂、低相对分子质量的抑制剂等。最常用的是玻璃纸袋，其截留相对分子质量极限一般在5000左右。透析袋的选择应根据欲提取酶的相对分子质量（大小）选定。由于透析主要是扩散过程，为了打破扩散平衡，需经常更换透析液，一般一天换2～3次，并且最好在0～4℃下透析，以防样品变性。透析脱盐是否完全可用化学试剂或电导仪检查。

②凝胶过滤　这是目前最常用的方法，不仅可除去小分子的盐，而且可除去其他小相对分子质量的物质。用于脱盐的凝胶有Sephadex G-10、G-15、G-25以及Bio-Gel P-2、P-4、P-6、P-10等。

（2）浓缩。

提取液或发酵液中酶的浓度一般很低，所以要加以浓缩。常用的浓缩方法如下。

①冷冻干燥法　这是目前最有效的方法之一，且最适宜于溶剂为水的酶溶液，它可将酶液制成干粉。酶液量大时可用大型冷冻干燥机。采用这种方法既能使酶浓缩，酶又不易变性，便于长期保存。但浓缩过程可能发生离子强度与pH变化，从而导致酶活力降低。

②超滤法　在一定的外加压力下，使待浓缩液通过只容许水和小分子选择性透过的微孔超滤膜，而酶等大分子被截留，浓缩的同时也可脱盐。只要膜选择恰当，浓缩过程还可能同时进行粗分。该法操作简便、快速且温和，操作中不产生相变化，成本低，因此使用较多。

③蒸发　工业生产中应用较多的是薄膜蒸发浓缩。在高度真空条件下使待浓缩的酶液变成极薄的液膜，并与热空气接触，其中水分能瞬时大量蒸发并带走部分热量。因此，只要真空条件好，酶在浓缩中受的影响不大，可用于热敏感性酶类的浓缩。

④凝胶吸水法　利用Sephadex G-25或G-50等能吸水膨润及吸收相对分子质量较小的化合物而酶等大分子被排阻的特性进行浓缩。将凝胶干燥粉末直接加入需要浓缩的酶液中混合均匀，经吸水膨润一定时间后，再用过滤或离心等方法除去凝胶，酶液就得到浓缩。这些凝胶的吸水量为每克1～3.7mL。该法条件温和，操作简便，且没有pH与离子强度等的改变。

⑤离子交换法　调节酶液的pH，使酶蛋白带一定的电荷，再让其通过离子交换柱，几乎所有的酶蛋白都会被交换吸附到柱上，然后改变pH或离子强度将其洗脱。常用的交换剂有DEAE Sephadex A-50、PAE Sephadex A-50等。

3.酶的结晶

酶的结晶是指缓慢地降低酶蛋白的溶解度，使其处于略过饱和状态，酶分子有规则周期性地排列成晶体而析出的过程。通常当酶的纯度达到50%以上时可以使其结晶。由于变性的蛋白质和酶不能结晶，因此，结晶既是酶是否纯化的标志，也是酶和杂蛋白分离纯化的手段。但有些药用酶并不需要结晶，且结晶酶不一定就是纯酶。

酶结晶常用以下几种方法。

（1）盐析法　在适当的pH、温度等条件下，保持酶的稳定，加入一定浓度的无机盐，中和酶蛋白表面电荷，并破坏其表面的水化膜而使酶结晶析出。酶制剂工业生产中，所用盐主要是硫酸铵和硫酸钠；实验室常用硫酸铵。盐析必须控制在低温下（一般在0℃左右），缓冲液pH接近酶的等电点。利用硫酸铵结晶时，一般是将盐加入比较浓的酶溶液中，并使溶液微呈混浊为止。然后放置，并且非常缓慢地增加盐浓度，以获得较好的结晶。

（2）有机溶剂法　有机溶剂的主要作用是降低溶液的介电常数，使酶蛋白分子间引力增强而溶解度降低。因此，在低温下向酶液中滴加有机溶剂能使酶结晶。本法的优点是结晶悬液中含盐少，缺点是易引起酶失活。因此，要选择使酶稳定的pH，且在低温下缓慢滴加有机溶剂，并不断搅拌；所使用的缓冲液一般不用磷酸盐，多用氯化物或乙酸盐，常用的有机溶剂为丙酮、乙醇或丁醇等。

（3）透析平衡法　将酶液装入透析袋中，置于一定饱和度的盐溶液或有机溶剂中进行透析平衡，袋中的酶可缓慢地达到过饱和状态而结晶。本法的优点是随着透析膜内外浓度差的减小，平衡速度也变慢，酶不易失活。大量样品和微量样品均可用此法结晶，因此是常用方法之一。

（4）等电点法　在等电点状态下，酶蛋白分子所带电荷为零，彼此之间的斥力最小，溶解度最低，因而容易结晶析出。但由于在等电点时仍有一定的溶解度，等电点法很少单独使用，多与其他方法组合使用。例如在盐析时，调节缓冲液pH接近酶的等电点而使酶结晶。

（四）酶的分析与纯度检测

酶类药物分析与检测的内容主要有酶活力测定、酶的纯度检测、酶效价测定等。酶活力测定往往贯穿生产的各个步骤，当提纯到一恒定的比活力时，即可认为酶已纯化，可对纯化的酶进行纯度检测和效价测定，以最终鉴定酶的质量。

1.酶活力测定

在酶的提取纯化过程中，几乎每一步骤前后都应进行酶活力测定，进行总活力与比活力的比较，以判断所选择的方法是否适宜和提取纯化的效果。关于如何进行酶活力测定可参考有关文献。如果待分离的酶已有报道，可参考其采用的测定方法和条件；如需要另建立新的酶活力测定方法，就得先对该酶反应动力学性质等有所了解，据此选择合适的底物和底物浓度、最适反应pH和温度等，同时确定一种相应的测定方法。

酶活力测定的方法很多，大致可分为两大类，即取样法和连续法。取样法的具体分析方法有化学法、光电比色法等，光电比色法是应用较广，又快捷方便的方法，化学法仍是常用的经济实用的方法。目前国内许多酶制剂生产厂采用这两种方法测酶活力。连续法需要一些特殊的设备，主要用于科研。

不管采用何种测定酶活力的方法，都必须符合下列要求。

（1）测定酶活力的时间应选择在初速度范围内。一般在反应开始后3～10 min，底物消耗量5%以内，可得到初速度。

（2）测定用的酶量必须和测得的酶活力呈线性关系。

（3）底物浓度大于酶浓度，以使在测定时间内，反应速度与底物浓度成正比。

另外，纯化过程中的酶活力测定应考虑：①对于分离纯化过程的酶活力测定，样品中的成分较为复杂，因此，应设置空白或对照，以便消除未知因素的影响；②为迅速了解纯化结果，要求测定方法快捷、简便，而准确度在一定程度上相对次要，甚至可容许5%～10%的误差，因此常用分光光度法、电学测定法等测定；③全酶在分离纯化过程中可能丢失辅助因子，因此，在反应系统中应加入相应的物质，如煮沸过的抽提液、辅酶、盐或半胱氨酸等，有时还要加入巯基乙醇或二硫苏糖醇等，以保护酶的巯基；④有时需要在测酶活力前进行透析或加入螯合剂等，以消除在纯化过程中引入的对酶的反应和测定有影响或干扰的某些物质。

酶活力通常用国际单位表示。但在纯化工作中，为求方便，也可自选规定的单位。工业酶制剂产品，经常标出酶活力是多少单位/毫升（U/mL）或单位/克，实际是酶浓度，有时也说是比活力。一般比活力越高，酶的纯度也越好，但并不能说明具体的纯净程度。

2.酶的纯度检测

在酶的分离提纯中，总活力用于计算某一抽提或纯化步骤后酶的回收率（Y），而比活力则用于计算某一纯化步骤的效果，即纯度的提高（E），其关系式如下：

Y=某步骤后的总活力/某步骤前的总活力

E=某步骤后的比活力/某步骤前的比活力

酶的回收率和纯度可作为选择纯化方法和条件的根据之一。但对所获得的酶是否均一纯净还要进行一定的纯度检测，其中许多分离方法（如电泳、超速离心、等电聚焦等）反映酶的均一性程度，因此，也用于检测酶纯度。

3.酶效价测定法

酶效价是指产品达到其目的作用的预期效能，它是根据该产品的某些特性，通过适宜的定量试验方法测定，以表明其有效成分的生物活性。效价测定均采用国际或国家参考品，或经过国家检定机构认可的参考品，以体内或体外法（细胞法）测定其生物活性，并标明其活性单位。酶类药物效价一般用单位质量的酶类药物所含有的酶的活力单位来表示。