胰岛素的生产和特性分析

2023-06-24 理论教育版权反馈

【摘要】：不同种属的动物胰岛素分子结构大致相同，主要差别在A链第8、9、10位上的三个氨基酸残基及B链C末端的一个氨基酸残基上，它们随种属而异，目前我国临床应用的是以猪胰腺为原料生产的胰岛素。在水溶液中胰岛素受pH、温度、离子强度的影响产生聚合和解聚现象。如及时用冷0.05 mol/L氢氧化钠溶液处理，仍可恢复为有活性的胰岛素结晶。胰岛素能发生蛋白质的各种特殊反应。牛胰岛素的相对分子质量为5733，猪胰岛素的相对分子质量为5764。

一、生产前准备

（一）查找资料，了解胰岛素的基本知识

胰岛素由16种51个氨基酸残基组成，有A、B两条肽链。人胰岛素A链有11种21个氨基酸残基，B链有15种30个氨基酸残基，其中A7（Cys）-B7（Cys）、A20（Cys）-B19（Cys）四个半胱氨酸残基中的巯基形成两个二硫键，将A、B两链连接起来。在A链中A6（Cys）与A11（Cys）之间也存在一个二硫键。不同种属的动物胰岛素分子结构大致相同，主要差别在A链第8、9、10位上的三个氨基酸残基及B链C末端（B30）的一个氨基酸残基上，它们随种属而异，目前我国临床应用的是以猪胰腺为原料生产的胰岛素。表1-4-4列出了人和几种动物的胰岛素结构差异，但它们的生理功能是相同的。

表1-4-4　人和几种动物的胰岛素结构差异

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续表

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胰岛素为白色或类白色结晶粉末，晶形为扁斜形六面体。人胰岛素相对分子质量为5784，等电点为5.3～5.4。牛胰岛素的相对分子质量为5733，猪胰岛素的相对分子质量为5764。胰岛素在pH4.5～6.5范围内几乎不溶，室温下溶解度为10 μg/mL。胰岛素易溶于稀酸或稀碱溶液，在80%以下乙醇或丙酮中溶解，在90%以上乙醇或80%以上丙酮中难溶，在氯仿或乙醚中不溶。胰岛素在弱酸性水溶液或混悬在中性缓冲液中较为稳定。在pH8.6下，溶液煮沸10 min即失活一半，而在0.25%硫酸中要煮沸60 min才能导致同等程度的失活。在水溶液中胰岛素受pH、温度、离子强度的影响产生聚合和解聚现象。在酸性（pH2）水溶液中加热至80～100℃，可发生聚合而转变为无活性纤维状胰岛素。如及时用冷0.05 mol/L氢氧化钠溶液处理，仍可恢复为有活性的胰岛素结晶。胰岛素能发生蛋白质的各种特殊反应。还原剂如硫化氢、甲酸、醛、乙酸酐、硫代硫酸钠、维生素C及多数重金属都能使胰岛素失活。

（二）确定生产技术、生产菌种和工艺路线

（1）确定生产技术：基因工程生产技术。

（2）确定生产菌种：基因工程菌株为RRhPI/PQE-40 E.coliM15菌株。

（3）确定基因工程技术生产胰岛素的工艺流程，如图1-4-5所示。

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图1-4-5　胰岛素生产工艺流程图

二、胰岛素生产工艺过程

（一）种子活化

取RRhPI/PQE-40 E.coliM15菌株，接种于3 mL LB/AK培养基中（含100 μg/mL氨苄青霉素、50 μg/mL卡那霉素），37℃220 r/min振荡培养12 h，然后取100μL接种于5 mL LB/AK培养基中，37℃220 r/min再振荡培养12 h，即得活化种子。活化种子可于4℃保存数周待用。

（二）发酵

1.一级发酵

将经过两级活化的5 mL LB培养液转至50 mL复合培养基中，恒温振荡12 h。

2.二级发酵

将50 mL经一级发酵扩培后的RRhPI/PQE-40 E.coliM15菌液转接到500 mL发酵培养基中（接种量为1∶10），恒温振荡培养12 h后加入IPTG诱导人胰岛素原的表达，迅速升温，继续恒温振荡培养12 h后结束发酵。4000 r/min离心15 min，沉淀即RRhPI/PQE-40 E.coliM15湿菌体，于-20℃保存。

（三）RRhPI/PQE-40 E.coliM15的发酵罐培养

将10 mL经过多级活化的RRhPI/PQE-40 E.coliM15转移至100 mL培养基中进行培养，12 h后，将其转移至含有1.5 L培养基的发酵罐中，培养12 h（转速为300 r/min，通气量为0.555～0.667 L/（L·min）），培养过程中加入一定量新鲜的培养基并用NaOH调节pH，之后加适量IPTG并升温诱导RRhPI的表达，随即调转速为400～500 r/min，增大通气量至0.500～0.555 L/（L·min），继续培养，收集菌体。

（四）包含体的收集与洗涤

（1）将收集的湿菌体冻存于-20℃，然后悬浮于缓冲液A（50 mmol/LTris-HCl、0.5 mmol/LEDTA、50 mmol/LNaCl、5%甘油、0.1～0.5 mmol/L DTT，pH7.9）中，加入溶菌酶（5 mg/g（湿菌体）），室温或37℃振荡2 h。冰浴超声（10 s/次）30次，期间每次间隔20 s，功率为200 W。

（2）裂解液在4℃下 14000 r/min离心15 min，收集沉淀，然后用含2 mol/L尿素的缓冲液A充分悬浮，室温静置30 min后，4℃下14000 r/min离心15 min，收集沉淀。将沉淀再用含2%脱氧胆酸钠的缓冲液A充分悬浮，4℃下14000 r/min离心15 min，收集沉淀。

（3）最后将沉淀用10 mmol/LTris-HCl（pH7.3）洗涤两次，每次洗涤后4℃下14000 r/min离心15 min。

（五）RRhPI的初步纯化

将收集的包含体用含有0.1%～0.3%β-巯基乙醇的缓冲液B（30 mmol/LTris-HCl、8 mol/L尿素，pH8.0）溶解，上样于已用缓冲液B平衡的DEAE-SepharoseFF（琼脂糖快速阴离子交换剂）柱，用0～0.1 mol/L氯化钠溶液梯度洗脱，收集含RRhPI的洗脱液。

（六）RRhPI的重组复性

将初步纯化后的RRhPI通过Sephadex G-25柱脱尿素，转换缓冲液为不同pH的50 mmol/LGly-NaOH重组液，或含有适量GSSG的Gly-NaOH缓冲液，使蛋白质终浓度为0.1～0.6 mg/mL，4℃下静置24 h。

（七）酶切

向RRhPI复性液中加入一定量的胰蛋白酶和羧肽酶B，37℃酶切，然后用0.1 mol/L ZnCl2终止反应并沉淀生成的胰岛素。

（八）纯化

胰岛素粗品用0.2 mol/LNaAc-HAc（pH4.0）溶解，在Superdex 75柱上进行纯化。层析平衡液及洗脱液均为0.2 mol/L NaAc-HAc（pH4.0）。

（九）质量检测

称取2.5 mg样品，加6 mol/L盐酸2 mL，110℃水解24 h，蒸干后加2 mL去离子水溶解，直接进样，在氨基酸分析仪上进行分析。