生产缬氨酸的实训项目

2023-06-24 理论教育版权反馈

【摘要】：国内外大批量生产L-缬氨酸主要采用微生物发酵技术。L-缬氨酸的离子交换提取一般用732树脂，该种强酸性阳离子交换树脂可选择性地从发酵液中吸附L-缬氨酸，从而将L-缬氨酸和其他氨基酸分离。L-缬氨酸发酵生产工艺如图1-3-7所示。

一、实训目标

（1）掌握L-缬氨酸发酵生产的技术要点。

（2）掌握离子交换法提取L-缬氨酸的基本原理、方法和基本操作技能。

（3）掌握离子交换法在氨基酸等药物提取和精制方面的应用。

二、实训原理

L-缬氨酸是三种支链氨基酸之一，是人体必需氨基酸，具有多种生理功能，主要用于配制复合氨基酸输液和口服液、合成多肽药物和食品抗氧化剂等。国内外大批量生产L-缬氨酸主要采用微生物发酵技术。L-缬氨酸是中性氨基酸，pI=5.96。在pH=2～3时，能最大限度地被强酸性阳离子交换树脂吸附。L-缬氨酸的离子交换提取一般用732树脂，该种强酸性阳离子交换树脂可选择性地从发酵液中吸附L-缬氨酸，从而将L-缬氨酸和其他氨基酸分离。L-缬氨酸发酵生产工艺如图1-3-7所示。

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图1-3-7　L-缬氨酸发酵生产工艺路线

三、实训器材和试剂

1.菌种

谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum CICC20887）。

2.器材

灭菌锅、恒温摇床、超净工作台、发酵罐、培养箱、三角瓶、铁架台、发水瓶、离子交换柱（φ40 mm×100 cm）、收集瓶、微量取样器、滤纸、层析缸、722型分光光度计。

3.药品与试剂

葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、琼脂条、硫酸铵、玉米浆，豆饼水解液、磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸锰、碳酸钙、L-Met、L-Ile、生物素、硫胺素、2 mol/L NaOH溶液、2 mol/L盐酸、0.3 mol/L氨水、正丁醇、丙酮、茚三酮、冰乙酸、缬氨酸标准样、硫酸、732树脂。

4.培养基

（1）斜面培养基配方（g/L）：葡萄糖5.0，NaCl 5.0，牛肉膏10.0，蛋白胨10.0，酵母膏5.0，琼脂条15.0。pH7，0.1 MPa下灭菌20 min。

（2）种子培养基配方（g/L）：葡萄糖40.0，硫酸铵5.0，玉米浆40.0，豆饼水解液2.5，磷酸二氢钾1.0，硫酸镁0.5，硫酸亚铁0.01，硫酸锰0.01，碳酸钙10.0，L-Met 0.3，L-Ile 0.2，生物素1.00×10-4，硫胺素2.00×10-4。pH7，0.1 MPa下灭菌20 min。

（3）发酵培养基配方（g/L）：葡萄糖80，硫酸铵25～40.0，玉米浆15.0，豆饼水解液2.5，磷酸二氢钾1.0，硫酸镁0.5，硫酸亚铁0.01，硫酸锰0.01，轻质碳酸钙10.0，L-Met 0.3，L-Ile 0.2，生物素1.00×10-4，硫胺素：2.00×10-4。pH7，0.1 MPa下灭菌20 min。

四、实训方法和步骤

（一）缬氨酸的发酵

（1）斜面活化培养：将保藏的菌种接种到斜面培养基，30℃恒温培养24 h。

（2）种子培养：将活化的种子接种到三角瓶中，200 r/min、30℃恒温振荡培养20～24 h，根据需要可进行1～3级种子的培养。

（3）发酵培养：按10%～15%（体积分数）的接种量将培养好的种子接种到5 L发酵罐中进行发酵。发酵条件：温度30℃，前24 h控制在pH6.5～6.7，后48 h控制在pH7.0～7.2，搅拌速度180 r/min，培养时间72 h。

（二）发酵液预处理

离心除去菌体，采用高速冷冻离心机高速（4500～6000 r/min）离心，分别收集菌体和上清液，回收的菌体可进一步加工利用，澄清的上清液用盐酸调节pH2～3后待用。

（三）缬氨酸的提取

1.树脂的预处理

将732树脂用蒸馏水洗涤数次后浸泡过夜，再用2 mol/L NaOH溶液和2 mol/L盐酸交替浸泡（或搅拌）2次，用2 mol/L的盐酸浸泡过夜，最后用蒸馏水冲洗至中性。

2.树脂的装柱

将离子交换柱垂直固定在铁架台上，在交换柱的下端配上橡皮塞及供液体流出的玻璃管和带螺丝夹的橡皮管，先将蒸馏水倒入离子交换柱中至1/3～1/2容积，同时将螺丝夹调到水能中速流出，然后用50 mL量筒取处理好的树脂缓缓倾入柱内水中，让树脂自然沉降，装50%～60%柱高。此时应注意不要让气泡进入树脂层，液面要始终高于树脂层2～3 cm。用乳胶管将分液漏斗与树脂柱连接好待用。

3.缬氨酸的交换

装好树脂后，用蒸馏水调节流速，使流出液达到1.0～1.5 mL/min即可，当液面降至比树脂面高2～3 cm时，由分液漏斗加入pH调节在2.5～3.0的已处理好的缬氨酸发酵液，用烧杯收集流出液，半小时后开始用pH试纸检测，每15 min一次，当pH接近4时再用纸层析法检测，每10 min一次。当流出液中缬氨酸的浓度与加入液中缬氨酸的浓度相同时，树脂即达到饱和，此时应停止交换（一般在相对含量为1%的时候就停止交换）。整个交换过程约2.5 h。

4.饱和树脂的洗涤

将饱和树脂用蒸馏水洗涤，直到流出液的pH为4.5～5.0即可（水用量一般为树脂体积的2倍）。洗涤时间约2 h。

5.缬氨酸的解析

洗涤后的饱和树脂，用蒸馏水调节流出液的流速为1.0 mL/（L·min）左右，当液面降至比树脂表面高2～3 cm时，由分液漏斗加入0.3 mol/L氨水洗脱，半小时后用pH试纸检测，每15 min一次，当pH接近4时再用纸层析法检测，以后每10 min一次。当含量达到0.3%时，开始收集。用烧杯收集洗脱液，以1～2 mL为一份测定含量。当流出液的相对含量在0.5%左右时，停止解析。收集时间约3 h。

6.树脂的再生

（1）水洗：解析完的树脂用蒸馏水洗至流出液的pH为8.0左右（水用量一般为树脂体积的2倍），洗涤时间约2 h。

（2）树脂再生：树脂用水洗好之后再用2 mol/L盐酸再生，流速控制在1.5 mL/（L·min）左右，当pH到2.0左右的时候就停止加酸（盐酸用量大约是柱体积的2倍）。

（3）水洗：再用蒸馏水洗至流出液的pH为4.5～5.0即可（水用量一般为树脂体积的2倍）。洗涤时间约2 h。

（四）样品的测定——纸层析法

1.标准曲线的制定

精密称取缬氨酸标准品0.06 g、0.14 g、0.22 g、0.30 g、0.38 g、0.46 g，分别用水溶解并置于10 mL容量瓶中，稀释至刻度，摇匀。分别吸取1 μL于层析滤纸上，以展开剂正丁醇-冰乙酸-水（3∶1∶1）展开，喷以茚三酮（0.5 g溶于100 mL丙酮中）显色，90℃烘箱中恒热5 min，可呈现玫瑰红斑点。将斑点剪下，分别置于试管中，以洗脱剂（0.05 g硫酸铜溶于77.5 mL 95%乙醇和22.5 mL水中）洗脱1 h，纸上斑点消失，以洗脱剂为空白对照，在722型分光光度计520 nm波长处测定洗脱液的吸光度，以缬氨酸的含量为横坐标，以洗脱液的吸光度为纵坐标，用Excel软件处理，得缬氨酸标准曲线和回归方程。

2.样品中缬氨酸含量的测定

将缬氨酸解析液稀释至40 mg/mL左右，取缬氨酸解析（稀释）液1 μL点样于层析滤纸上，照上法操作，测得吸光度，从标准曲线上换算出缬氨酸含量。

五、实训结果处理

请填写732树脂交换解析缬氨酸的洗脱体积和吸光度对应表（见表1-3-1）。

表1-3-1　732树脂交换解析缬氨酸的洗脱体积和吸光度对应表

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