氨基酸类药物生物生产技术优化

2023-06-24 理论教育版权反馈

【摘要】：目前构成天然蛋白质的20种氨基酸的生产技术主要有天然蛋白质水解技术、微生物发酵生产技术、酶法合成技术、化学合成法。（一）天然蛋白质水解技术以毛发、血粉及废蚕丝等蛋白质为原料，通过酸、碱或酶水解成多种氨基酸混合物，经分离纯化获得各种药用氨基酸的技术称为天然蛋白质水解技术。发酵所用菌种主要是细菌、酵母菌，现代生物工程采用细胞融合技术及基因重组技术改造微生物细胞，已获得多种高产氨基酸杂种菌株及

氨基酸的生产始于1820年，用蛋白质酸水解生产氨基酸，1850年化学合成氨基酸，1956年分离到谷氨酸棒状杆菌，日本采用微生物发酵法工业化生产谷氨酸成功，1957年谷氨酸钠（味精）的生产商业化，从此推动了氨基酸生产的大发展。目前构成天然蛋白质的20种氨基酸的生产技术主要有天然蛋白质水解技术、微生物发酵生产技术、酶法合成技术、化学合成法。其中微生物发酵生产技术和酶法合成技术是主要的生产技术。

（一）天然蛋白质水解技术

以毛发、血粉及废蚕丝等蛋白质为原料，通过酸、碱或酶水解成多种氨基酸混合物，经分离纯化获得各种药用氨基酸的技术称为天然蛋白质水解技术。目前用水解法生产的氨基酸有L-胱氨酸、L-精氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-组氨酸、L-脯氨酸及L-丝氨酸等。

水解法生产氨基酸的主要过程包括水解、分离和结晶精制三个步骤。

1.水解方法

目前蛋白质水解方法分为酸水解法、碱水解法及酶水解法三种。

（1）酸水解法　蛋白质原料用6倍的6～10 mol/L盐酸或8 mol/L硫酸于110～120℃（回流煮沸）水解12～24 h，除酸后即得多种氨基酸混合物。此法优点是水解迅速而彻底，产物全部为L型氨基酸，无消旋作用。缺点是色氨酸全部被破坏，丝氨酸及酪氨酸部分被破坏，且产生大量废酸污染环境。

（2）碱水解法　蛋白质原料经6 mol/L氢氧化钠溶液或4 mol/L氢氧化钡溶液于100℃水解6 h，即得多种氨基酸混合物。该法水解迅速而彻底，且色氨酸不被破坏，但含羟基或巯基的氨基酸全部被破坏，且产生消旋作用。工业上多不采用。

（3）酶水解法　蛋白质原料在一定pH和温度条件下经蛋白水解酶作用，分解成氨基酸和小肽的方法称为酶水解法。此法优点为反应条件温和，不需特殊设备，氨基酸不被破坏，无消旋作用。缺点是水解不彻底，产物中除氨基酸外，尚含较多肽类。工业上很少用该法生产氨基酸，主要用于生产水解蛋白及蛋白胨。

2.氨基酸分离方法

氨基酸分离方法较多，通常有溶解度法、等电点沉淀法、特殊试剂沉淀法、吸附法及离子交换法等。

（1）溶解度法　溶解度法是依据不同氨基酸在水或其他溶剂中的溶解度差异而进行分离的方法。例如，胱氨酸和酪氨酸均难溶于水，而其他氨基酸则较易溶解，但在热水中酪氨酸溶解度较大，而胱氨酸溶解度变化不大，利用这个性质可将混合物中胱氨酸、酪氨酸及其他氨基酸彼此分开。另外，由于氨基酸是两性电解质因而有等电点，且在等电点时溶解度最小，最容易沉淀析出，因此可利用此性质，用溶解度法结合等电点沉淀法来分离氨基酸，效果更好。

（2）特殊试剂沉淀法　特殊试剂沉淀法是采用某些有机或无机试剂与相应氨基酸形成不溶性衍生物而分离氨基酸的方法。例如：邻二甲苯-4-磺酸能与亮氨酸形成不溶性盐沉淀，后者与氨水反应又可获得游离亮氨酸；组氨酸可与HgCl2形成不溶性汞盐沉淀，后者经处理后又可获得游离组氨酸；精氨酸可与苯甲醛生成水不溶性苯亚甲基精氨酸沉淀，后者用盐酸除去苯甲醛即可得精氨酸。

（3）吸附法　吸附法是利用吸附剂对不同氨基酸吸附能力的差异进行分离的方法。例如，颗粒活性炭对苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸的吸附能力大于对其他非芳香族氨基酸的吸附能力，故可从氨基酸混合液中将上述氨基酸分离出来。

（4）离子交换法　氨基酸为两性电解质，在特定条件下，不同氨基酸的带电性质及解离状态不同。离子交换法就是利用离子交换剂对不同氨基酸吸附能力的差异，通过静电引力将溶液中的待分离氨基酸吸附在树脂上，然后利用合适的洗脱剂将被吸附的氨基酸从树脂上洗脱下来，对氨基酸混合物进行分组或获得单一成分，从而达到分离、纯化和浓缩的目的。

离子交换树脂是一种不溶性的固体物质，其本身由两部分组成：一部分是由聚苯乙烯及其衍生物形成的不溶性骨架，上面带有一定数量的带电基团；另一部分是靠静电力吸引在骨架上的可交换离子，它们可以和其他带同种电荷的离子进行可逆交换。如骨架带正电基团，可交换离子则为阴离子，这种交换树脂可以和阴离子进行交换，所以称为阴离子交换树脂；反之，称为阳离子交换树脂。用阳离子交换柱时，氨基酸一般按照酸性、中性、碱性氨基酸的顺序先后被洗脱。在带相同电荷的情况下，极性大的氨基酸先被洗脱下来。用阴离子交换柱时，氨基酸的洗脱顺序与用阳离子交换柱时相反。

常规的离子交换法是采用苯乙烯磺酸型强酸性阳离子交换树脂分别将酸性氨基酸、中性氨基酸、碱性氨基酸进行分离。其交换顺序为

精氨酸＞赖氨酸＞组氨酸＞苯丙氨酸＞亮氨酸＞蛋氨酸＞缬氨酸＞丙氨酸＞甘氨酸＞谷氨酸＞丝氨酸＞苏氨酸＞天冬氨酸

离子交换法具有成本低、操作方便、提取率高、设备简单等优点，常用于蛋白质、氨基酸、核酸、酶及抗生素等的分离提纯。

3.氨基酸的精制方法

分离出的特定氨基酸中常含有少量其他杂质，需进行精制。结晶是纯化精制物质的有效手段，常用的有结晶和重结晶技术。例如，丙氨酸在稀乙醇或甲醇中溶解度较小，且pI为6.0，故丙氨酸可在pH6.0时，用50%冷乙醇结晶或重结晶加以精制。也可采用溶解度法或结晶与溶解度法相结合的技术精制氨基酸。例如，在沸水中苯丙氨酸溶解度比酪氨酸大100倍，若将含少量酪氨酸的苯丙氨酸粗品溶于15倍质量的热水中，调pH至4.0左右，经脱色过滤可除去大部分酪氨酸，滤液浓缩至原体积的1/3，加2倍体积的95%乙醇，4℃下放置，过滤，用95%乙醇洗涤晶体，烘干即得苯丙氨酸精品。

（二）微生物发酵生产技术

微生物发酵生产技术是利用某种能够合成所需氨基酸的微生物，通过对其诱变处理，选育出营养缺陷型及氨基酸结构类似物抗性突变株，以解除代谢调节中的反馈抑制和反馈阻遏作用从而使其过量积累所需氨基酸，以氨或尿素为氮源，以糖为碳源，通过微生物的发酵繁殖，直接生产氨基酸，或利用微生物细胞中酶的作用，将培养基中前体物质转化为特定氨基酸的技术。微生物发酵生产氨基酸的基本过程包括培养基配制与灭菌处理，菌种诱变与选育，菌种培养、灭菌及接种发酵，产品提取及分离纯化等步骤，如图1-3-1所示。发酵所用菌种主要是细菌、酵母菌，现代生物工程采用细胞融合技术及基因重组技术改造微生物细胞，已获得多种高产氨基酸杂种菌株及基因工程菌。例如，用北京棒状杆菌和钝齿棒状杆菌原生质体融合形成杂种，其中70%的杂种细胞产生两亲菌株所产生的氨基酸。

pagenumber_ebook=85,pagenumber_book=72