头孢霉素发酵生产实训项目

2023-06-24 理论教育版权反馈

【摘要】：掌握头孢霉素发酵生产的一般工艺流程、提取和精制方法。头孢霉素发酵生产工艺路线如图1-2-12所示。发酵过程中，及时测定菌丝浓度、还原糖浓度、头孢霉素C浓度。表1-2-4荧光分光光度法在头孢霉素类药物含量测定上的应用图1-2-12头孢霉素发酵生产工艺路线三、实训器材和试剂1.菌种顶头孢霉。

一、实训目标

（1）熟练掌握发酵工程的基本原理和操作。

（2）掌握抗生素发酵生产的一般工艺流程。

（3）掌握头孢霉素发酵生产的一般工艺流程、提取和精制方法。

二、实训原理

头孢霉素（见图1-2-11）生产菌种子周期长达172 h，而发酵周期只有（126±4）h，目前，国内外头孢霉素生产一直采取补料分批发酵法，通过改进现行补料工艺，采用补料并定时放料分批发酵（半连续发酵），提高了头孢霉素的生产效率，使发酵指数和罐批产量有了较大幅度的提高。头孢霉素发酵生产工艺路线如图1-2-12所示。

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图1-2-11　头孢霉素的化学结构

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图1-2-12　头孢霉素发酵生产工艺路线

三、实训器材和试剂

1.菌种

顶头孢霉（Acremomium chrysogenum）。

2.试剂

DL-蛋氨酸（缬氨酸或半胱氨酸或α-氨基己二酸或丙二酸）、玉米浆、蔗糖、葡萄糖、豆油、CaCO3、淀粉、糊精、MgSO4、（N H4）2 SO4、FeSO4、MnSO4、ZnSO4、CuSO4等。

3.器材

超净工作台、发酵罐、培养箱、振荡摇床、pH计等。

4.培养基

（1）产孢培养基：淀粉1%、玉米浆（干重）1%、NaCl 0.3%、（NH4）2SO40.3%、CaCO3 0.25%、pH7.0～7.2。

（2）种子培养基（g/L）：玉米浆70.0、蔗糖3.3、葡萄糖16.7、DL-蛋氨酸6.0、豆油10.0、CaCO310.0、KH2PO44.0、（NH4）2SO48.0、FeSO4·7H2O0.05。pH为6.2。

（3）发酵培养基：玉米浆3%、淀粉3%、糊精6%、蛋氨酸0.3%、葡萄糖1.0%、油1%、CaCO31.0%，pH为6.0～6.1。

四、头孢霉素发酵生产的方法和步骤

1.菌种筛选

（1）孢子培养：将固体培养基培养好的顶头孢霉转接到产孢培养基上，25℃培养3～6 d，收集分生孢子。

（2）紫外线诱变：利用紫外线照射，致死率在90%以上，利用高浓度半胱氨酸培养基筛选头孢霉素产量高的菌株。

2.发酵培养

（1）种子培养：将诱变好的孢子接种到一级种子培养基，28℃培养76 h，按接种量为10%接种到二级种子培养基中，28℃培养40 h。

（2）发酵培养：从二级种子培养液中转接到发酵罐中，接种量为20%。发酵参数主要从温度、罐压、空气流量、搅拌速度、补料流加速度、菌体浓度、pH、头孢霉素C发酵单位、溶氧浓度、碳源浓度和氮源浓度等。搅拌速度为700 r/min；发酵过程中用28%氨水控制发酵液pH，维持在5.5～5.6；温度0～40 h控制在28℃，40 h以后，控制在25℃。0～24 h，氧气控制在0.5 L/（L·min），罐压控制在0.05 MPa；24～28 h，氧气控制在0.7 L/（L·min），罐压控制在0.07 MPa；48～72 h，氧气控制在1.1 L/（L·min），罐压控制在0.07 MPa；72～130 h，氧气控制在1.2 L/（L·min），罐压控制在0.07 MPa。发酵过程中，及时测定菌丝浓度、还原糖浓度、头孢霉素C浓度。

五、头孢霉素分离提取的方法和步骤

（1）酸化：将发酵液pH调至5.0，使部分蛋白质及钙离子沉淀。

（2）收集滤液：离心收集，5000 r/min离心10 min，收集上清液；超滤收集，利用Flow-Cel膜系统超滤发酵液收集滤液，超滤进料压力维持在0.4 MPa，透过压力为0.05 MPa，每次料液用量为250 mL，温度维持在15℃。菌丝体及其他沉淀弃去。

（3）吸附性树脂吸附与解析：利用XAD-1600吸附滤液中的头孢霉素C。装柱，将发酵液上样，用5%、10%、15%、20%丙酮溶液或乙醇或异丙醇溶液洗脱，收集洗脱液。用NaOH、H2SO4、乙醇、丙酮等溶剂对树脂进行浸泡、洗脱和再生。

（4）离子交换树脂纯化：离子交换树脂有Ambedite IRA-68、Ambedite IR-4B等。吸附完毕后，用乙酸钠溶液解吸，乙酸钠溶液浓度从0 mmol/L至10 mmol/L，按0.5 mmol/L级差逐步增加，洗脱。

（5）结晶：用液氮将料液预冷至10℃以下，搅拌，加入部分预冷至0～10℃的丙酮（解吸液体积0.5倍）。快速加入乙酸锌至结晶液变混浊。停止搅拌，静置1h。再搅拌，继续加入剩余丙酮，在10℃以下静置4 h。

（6）干燥：将结晶液用真空泵抽滤，用丙酮水、丙酮洗涤两次，再用真空泵将洗液抽净。将洗涤后的头孢霉素C锌盐放入干燥箱中，真空干燥。

（7）头孢霉素C含量测定：①头孢霉素类药物由于环状部分具有O=C—N—C=C结构，在260 nm波长处有强吸收，故可用分光光度法进行定量分析；②头孢霉素类药物在碱性条件下的降解产物可能是二酮哌嗪衍生物，具有荧光性，故可用荧光分光光度法测定血浆中头孢霉素类药物的含量（见表1-2-4）；③用HPLC测定，色谱柱为C18，4.6 mm×25 mm，流动相为乙腈-乙酸钠缓冲液（1∶50），进样量为20 μL，流速为2.0 mL/min，检测波长为254 nm。

表1-2-4　荧光分光光度法在头孢霉素类药物含量测定上的应用

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六、结果处理

计算头孢霉素的提取率。

七、知识和技能探究

（1）头孢霉素与青霉素的分离提取有何区别？

（2）如何提高头孢霉素的产量？

头孢霉素发酵生产实训项目

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