认识生物制药下游技术

2023-06-24 理论教育版权反馈

【摘要】：生物化学药物由于其原料为动植物器官或组织，也要经过下游操作实现对目标物的获取。实际上，化学制药及中药生产过程中，也存在分离纯化的过程，并直接影响整个生产质量，因此，生物制药下游技术是通用于目前制药过程的操作技术，只是由于分离纯化原料不同，实际操作过程中会有差异。其技术水平和发展趋势对生物化学药物的发展产生重要的影响，常被称为生物工程的下游技术。

一、基本知识

（一）生物制药下游技术的作用

生物制药过程中，微生物菌种或动植物细胞经过培养后的发酵液或培养物经过提取、分离、纯化等过程，最终得到符合要求的生物化学药物。这个过程大致可以分为上游、中游、下游三个阶段。上游主要包括菌种的筛选和优化，利用基因工程、细胞工程等技术构建工程菌或工程细胞。中游主要包括对以上微生物或者细胞进行扩增、培养，得到足够的培养物。下游主要包括对以上培养物进行分离纯化操作，最终得到符合要求的产品。生物化学药物由于其原料为动植物器官或组织，也要经过下游操作实现对目标物的获取。实际上，化学制药及中药生产过程中，也存在分离纯化的过程，并直接影响整个生产质量，因此，生物制药下游技术是通用于目前制药过程的操作技术，只是由于分离纯化原料不同，实际操作过程中会有差异。

（二）基本概念

（1）生化分离技术　生化分离技术是指从动植物组织培养液或微生物发酵液中分离、纯化生物产品的过程中所采用的方法和手段的总称。其技术水平和发展趋势对生物化学药物的发展产生重要的影响，常被称为生物工程的下游技术。

（2）提取　提取是指在操作分离过程中用适当的溶剂将目标物溶出并与原材料其他部分分开，实现从原材料中获取目标物的过程。提取的过程一般操作简单，处理量大，并且随目标物一并被提取出来的还有许多杂质，需要进一步分离纯化。

（3）分离　分离也指初步纯化，即通过一定的操作方法，将目标物与杂质分开的过程。经过分离操作后，目标物的纯度有明显提高，杂质含量减少。

（4）纯化　经过分离的样品，虽然目标物纯度较高，杂质含量较小，但这是相对的，要得到能够用于临床的药品，特别是能够符合药典等相关法规的要求，仍然需要进一步进行分离操作，得到纯度更高的目标物。

（5）失活　失活指某些具有生物活性的物质（如蛋白质、氨基酸、基因等）受物理或化学因素的影响，其生物活性丧失的现象。分离纯化过程中，经过一系列分离纯化操作后，目标物的活性可能降低或消失，主要是受到温度、pH、酸碱度等影响，目标物的结构发生了改变，从而影响到其活性。

二、生物制药基本下游技术

生物制药下游技术一般包括预处理、细胞分离、细胞破碎、初步纯化、高度纯化、浓缩干燥等步骤，每一操作步骤都有几种方法可供选择，如图1-1-9所示。

（一）生物材料的预处理技术

生物材料包括各种生物组织、动物细胞培养液、植物细胞培养液、微生物发酵液、动物血液、乳液等。这些材料中目标物浓度普遍比较低，组分非常复杂，是细胞、细胞碎片、蛋白质、核酸、脂类、糖类、无机盐类等物质的混合物，杂质较多，目标物分布方式分为胞内与胞外两种，不同的存在方式决定了不同的处理方法。此外，有些目标物在分离过程受空气氧化、微生物污染、蛋白水解作用、pH、离子强度、温度等因素影响而发生变化，比如发生失活现象。因此，对生物材料进行适当预处理，才能为后续操作奠定基础，并保护目标物不被破坏。

对生物材料进行预处理，要根据目的的不同选择合适的方法。

（1）根据生物活性物质的存在方式与特点选择预处理方法。对于胞外物质，可以从其细胞外液中得到；胞内物质的提取要先破碎细胞，使胞内产物获得最大限度的释放；对于膜上物质，则要选择适当的溶剂使其从膜上溶解下来。如采用玻璃匀浆器、组织捣碎器或反复冻融法对细胞进行破碎处理等。

（2）为便于后续操作选择预处理方法。分离纯化目标物过程中，首先要进行液固分离，将目标物溶液与材料残渣分开，并要求溶液澄清、pH适中、目标物有一定的浓度，但不同的提取工艺路线对溶液质量的要求不完全相同，预处理时也要相应采用不同的方法。例如在链霉素生产过程中，通过较剧烈的变性和处理条件，使蛋白质类杂质变性沉淀，并进行加热处理，有利于提高过滤速度。加入凝聚剂、絮凝剂、沉淀剂等处理，有助于液固分离。如果后续工艺中需用离子交换法，则对滤液中无机离子、灰分含量、澄清度方面要求比较严格。如果采用溶剂萃取法，则要求蛋白质含量较低，以减轻乳化现象。

（3）为保证目标物稳定性选择预处理方法。在分离纯化过程中，受各种因素影响，目标物的生理活性处于不断变化之中，在整个过程中都要防止目标物的失活。如果目标物容易失活，需要通过预处理加入保护剂；如果目标物需要活化，则要加入活化剂。例如：青霉素在酸性条件下稳定性较差，发酵液pH只能控制在4.8～5.2，并且在低温下操作；对蛋白质类药物，要防止其结构的破坏，尤其是高级结构的破坏，因此要避免高热、强烈搅拌、强酸、强碱及重金属离子的作用等。

（二）液固分离技术

液固分离是将悬液中的固体和液体分离的过程，如将生物组织的提取液与细胞碎片分离，将发酵液中细胞、菌体、细胞碎片以及蛋白质沉淀物分离等。常规的液固分离技术主要有过滤和离心分离等。

（三）沉淀分离技术

在生化物质的提取和纯化的整个过程中，目标物经常作为溶质而存在于溶液中，改变pH、离子强度等溶液条件，使目标物的溶度积发生变化，可以使它以固体形式从溶液中分离出来。这种方法广泛应用于抗生素、有机酸、多肽、核酸、蛋白质等物质的分离。一般析出物为无定形固体时称为沉淀法，析出物为晶体时称为结晶法。根据操作过程不同，主要分为盐析法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法、结晶法等。

（四）膜分离技术

膜分离技术与过滤分离技术较为相似，过滤介质是实现分离的直接手段。但普通过滤分离是固体颗粒水平的液固分离；膜过滤主要集中在分子、离子水平的操作，其中有透析、微滤、超滤、反渗透等，它们都依赖于各种新型人工膜和膜分离装置的出现，成为现代生化分离、制备的有效手段。

（五）层析分离

层析分离技术又称色谱法，是利用不同物质理化性质的差异而建立起来的技术。层析系统由两个相组成：一是固定相，也称为分离介质，常被填充于层析柱中；另一是流动相，流过整个层析柱，并与分离介质接触。当待分离的混合物随流动相通过固定相时，由于各组分的理化性质存在差异，与流动相和固定相发生相互作用的能力不同，随流动相向前移动时，各组分不断地与两相相互作用，样品中各个组分的距离逐渐拉开，并相继流出层析柱，从而达到将各组分分离的目的。根据原理不同，层析分离技术主要包括吸附层析、凝胶层析、离子交换层析、疏水层析、亲和层析等。

（六）电泳分离

在电解质溶液中，位于电场中的带电粒子在电场力的作用下，以不同的速率向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象，称为电泳。不仅是小的离子，生物大分子，如蛋白质、核酸、病毒颗粒、细胞器等带电颗粒也可以在电场中移动，由于不同组分所带电荷及性质的不同，迁移速率不同，可实现分离。电泳包括聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦、双向电泳、毛细管电泳等。

（七）其他分离技术

除了以上介绍的分离技术外，还有一些分离技术也得到很好的发展，并已经用于生产。如各种萃取技术，利用不同组分在互不相溶的两种溶剂中溶解性能的差异实现分离；差速离心、密度梯度离心分离技术利用不同物质沉降特性的差异实现组分的分离；反胶束萃取法利用表面活性剂在溶液中形成反胶束，既能够容纳目标物，又能够保护其不失活，适合于蛋白质的提取等。

（八）成品浓缩干燥技术

在生物化学药物生产过程中，由于目标物在生物材料中含量较低，并且在分离纯化过程中不断损失，要想得到足够量的目标物，需要处理足够的材料，并使用大量的溶剂。此外，在许多分离纯化步骤中，都要用到溶剂对组分进行溶解，尤其在柱层析过程中，为了实现组分的分离，常常需要很多流动相，导致含有目标物的溶液体积大、浓度低。为便于后续操作和样品保存，需要对这些溶液进行浓缩或干燥。

浓缩和干燥在本质上都是将溶液中溶剂除去的过程，只是程度不同。浓缩是指从溶液中除去部分溶剂（蒸发），溶质浓度增大的过程；干燥是指从溶液或者湿物料中除去溶剂，制备固体目标物的过程。浓缩和干燥过程中常使用加热的方法促使溶剂快速蒸发，但是有些生物化学药物对热不稳定，容易变性和失活，或者在有水存在的情况下长时间受热容易被破坏，使常规加热浓缩方法的使用受到很大限制。目前，使用较多的是真空减压浓缩法、喷雾干燥法和真空冷冻干燥法。

三、下游技术的选择

下游技术与生物技术发展密切相关，并始终处于不断发展之中。各种基因工程、细胞工程等生物技术为我们获得生物活性物质提供了可能，但也依赖于生化分离技术，将目标物从各种生物材料中分离出来，才能开展进一步的研究和应用。分离目标物的同时，经常会面临目标物含量低、干扰成分复杂等问题，究竟选择哪种分离纯化技术，都要根据目标物的性质和杂质的情况，依据充分的理论依据和实践经验合理选择，实际操作中，不乏多种手段联用的情况。同时，在操作中，要注意控制操作的各项条件，以利于后续操作和保证目标物的活性。

认识生物制药下游技术

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