认知动物细胞工程制药技术

细胞工程是以细胞为单位，按照人的意志，应用细胞生物学、分子生物学等理论和技术，有目的地进行精心设计、精心操作，使细胞的某些遗传特性发生改变，从而达到改良或产生新品种的目的，以及使细胞增加或重新获得产生某种特定产物的能力，在离体条件下进行大量培养、增殖，并提取出对人类有用的产品。这是一门应用科学和工程技术，它包括真核细胞的基因重组、导入、扩增和表达的理论和技术，细胞融合的理论和技术，细胞器特别是细胞核移植的理论和技术，染色体改造的理论和技术，转基因动植物的理论和技术，细胞大量培养的理论和技术，以及将有关产物提取纯化的理论和技术。

一、动物细胞的形态

动物细胞的结构较原核细胞的复杂得多，而且已不是靠一个细胞包办一切生理活动，各种细胞都有明确的分工。为了适应其功能的需要，细胞的形态也有相应的变化，这种变化称为分化（或称特化）。然而当细胞离体培养时，这些分化的形态经常发生变化。通常将离体培养的细胞分为三类，即贴壁依赖型细胞（简称贴壁细胞）、非贴壁依赖型（简称悬浮细胞）和兼性贴壁细胞。

（1）贴壁细胞　这类细胞的生长必须有可以贴附的支持物表面，细胞依靠自身分泌的或培养基中提供的贴附因子才能在该表面上生长、增殖。当细胞在该表面生长后，一般形成两种形态，即成纤维样细胞型和上皮样细胞型。

（2）悬浮细胞　这类细胞的生长不依赖支持物表面，可在培养液中呈悬浮状态生长，如血液内的淋巴细胞和用以生产干扰素的Namalwa细胞等，细胞呈圆形。

（3）兼性贴壁细胞　在实践中还可以看到有些细胞并不严格地依赖支持物，它们既可以贴附于支持物表面生长，在一定条件下，还可以在培养基中呈悬浮状态良好地生长，这类细胞称为兼性贴壁细胞，如常用的中国仓鼠卵巢（Chinese hamster ovary）细胞、小鼠L929细胞。当它们贴附在支持物表面生长时呈上皮细胞或成纤维细胞的形态，而当悬浮于培养基中生长时则呈圆形，有时它们又可相互支持贴附在一起生长。

二、动物细胞的生理特性

动物细胞的生理和生长特点与细菌、酵母和植物细胞有很大的不同。动物细胞大致有以下特点：细胞的分裂周期长；细胞生长需贴附于基质并有接触抑制现象；正常二倍体细胞的生长寿命有限；对周围环境十分敏感；对培养基的要求高；对蛋白质的合成途径和修饰功能与细菌不同。而这些特点决定了动物细胞的培养和用动物细胞大量生产生物制品有其独特的优势和难度。

三、生产用动物细胞的要求和获得

（一）生产用动物细胞的要求

最早的生物制品法规规定，只有从正常组织中分离的原代细胞（如鸡胚细胞、兔肾细胞等）才能用来生产生物制品。后来放宽至只要是二倍体细胞，即使经多次传代也可用于生产，如WI-38、2BS细胞等。最后，人们证实了异倍体细胞也是无害的，于是取消了对传代细胞的限制。

（二）生产用动物细胞的获得

用于生产的动物细胞不外乎上述几类，即原代细胞、已建立的二倍体细胞系、可无限期传代的转化细胞系，以及用这些细胞进行融合和重组的工程细胞系。

（1）原代细胞　原代细胞是直接取自动物组织、器官，经过粉碎、消化而获得的细胞悬液。

（2）二倍体细胞系　原代细胞经过传代、筛选、克隆，从而从多种细胞成分的组织中挑选并纯化出某种具有一定特征的细胞株。

（3）转化细胞系　这类细胞是通过某个转化过程形成的，它常常由于染色体的断裂变成了异倍体，从而失去了正常细胞的特点，而获得了无限增殖的能力。

（4）融合细胞系　细胞融合是指两个或两个以上的细胞合并成一个细胞的过程。在自然情况下，受精过程就属于这种现象。

（5）重组工程细胞系　重组工程细胞是采用基因工程的手段构建的各种工程细胞。

尽管原代细胞、二倍体细胞系、转化细胞系三者都仍被用于生产中，但在生产中采用更多的、更有前景的是融合细胞和重组工程细胞。

四、动物细胞的培养条件和培养基制备

为了使细胞在体外培养成功，必须保证一些基本条件：①所有与细胞接触的设备、器材和溶液都保持绝对无菌，避免细胞外微生物的污染；②有足够的营养供应，绝对不可有有害的物质，避免即使是极微量的有害离子的掺入；③有适量的氧气供应；④需要随时清除细胞代谢中产生的有害产物；⑤有良好的适于生存的外界环境，包括pH、渗透压和离子浓度；⑥及时分种，保持合适的细胞密度。

五、动物细胞培养的基本方法

细胞培养的方法，一般可以根据培养细胞的种类分为原代细胞培养和传代细胞培养；又可以根据培养基的不同分为液体培养和固体培养；还可以根据培养容器和方式不同分为静置培养、旋转培养、搅拌培养、微载体培养、中空纤维培养、固定化培养等。但不管采用哪种方法，其基本技术大同小异。

（一）细胞分离

培养细胞，首先要从生物体取得细胞，目前获取细胞的方法有两种，即离心分离法和消化分离法。

（二）细胞计数

一般在细胞分离制成悬液（悬浮液）准备接种培养前都要进行细胞计数，然后按需要量接种于培养瓶或反应器中。另外在观察细胞增长变化时，以及观察药物对细胞的抑制作用时，也都要反复进行细胞计数。目前常用的计数法有自动细胞计数器计数和血球计数板计数。用血球计数板计数时计算公式如下：

公式中之所以要乘以10000，是因为四角每一大格的面积为1 mm2，而盖片与计数板之间的间隙为0.1 mm深，故该区域内的液体量仅为0.1 mm3，要换算成每毫升细胞数就要扩大10000倍。

为了区别细胞的死活，在计数前可进行细胞染色。常用的染色液包括：①台盼蓝，细胞悬液与0.4%台盼蓝溶液按9∶1混匀，此时死细胞呈蓝色，计数时可分开；②苯胺黑，染色时细胞悬液和染液比同台盼蓝。

（三）细胞传代

无论是悬浮细胞还是贴壁细胞的培养，当细胞增殖到一定程度，由于各种因素，包括培养条件、代谢废物的浓度、pH，以及氧的供应等因素的限制，特别是许多贴壁生长的二倍体细胞都具有接触抑制的特性，因此细胞的密度不可能无限制增加。如不及时分种，细胞就会死亡、脱落。故在细胞的培养过程中需注意及时地传代。一般来说，二倍体只能传40～50代，而异倍体细胞可无限制地进行传代。

（1）悬浮细胞的传代　悬浮细胞的传代比较容易，只要加入一倍或几倍的生长液，然后分种两个或多个培养瓶即可。

（2）贴壁细胞的传代　贴壁细胞的传代需经消化液消化后再分种。在分种过程中需注意以下事项：①消化前需先用肉眼或显微镜下观察待消化的细胞，确认细胞有无污染，若怀疑有污染则去除；②加入的消化液量要适当，以摇动时能盖满单层细胞为度；③消化时间不宜过久，一般在室温静置2～5 min（也可在37℃下保温），当见细胞层出现麻布样网孔时，即可倒去消化液，初次操作时怕把握不好时机，可在显微镜下观察，当细胞分离变圆，即可停止消化，也可在加入消化液并轻轻摇动后即倒去消化液，靠少量残液继续作用；④终止消化时先要去掉消化液，然后加入有血清的培养基；⑤分种数量取决于细胞数和细胞特性，多数细胞分种以每毫升20万～30万个、每次1传2或1传3为好，有的细胞可分种得更多；⑥已培养过的瓶子可再次使用，但一般不要超过2～3次；⑦二倍体细胞培养时每次传代必须写上传代次数；⑧传代后一般每天或隔天换液，每3～5 d就要传代一次。

（四）细胞的冻存和复苏

（1）细胞的冻存　保存细胞都采用液氮低温（-196℃）冻存的方法。为了防止电解质过分浓缩，可采用某些保护剂，如甘油和二甲基亚砜。在冷冻时，冷冻速度很重要，不能太快，也不能太慢。太慢会产生冰晶损伤细胞，太快则不足以使水分排出。一般以1℃/min的速度下降为宜。在无定速降温设备时，可按以下三种方法之一处理：①将安瓿放在壁厚为1.5 cm的聚乙烯盒内，然后放在-70℃冰箱内2 h，再转入液氮；②先将安瓿置于冰箱中4～5 h或过夜，再移至-70℃冰箱内2 h，然后悬于液氮罐颈口1 h，最后浸入液氮；③放在冻存简易装置内，置于液氮罐颈口，离液氮面5～10 cm，2～3 h后浸入液氮。

（2）细胞的复苏　复苏时，总的要求是快融。在实际操作中需注意以下几点：①为了防止因玻璃安瓿封口不好，在融化时渗入的液氮引起安瓿爆炸，在操作中要注意防护，戴面罩和手套；②从液氮罐取出的安瓿应立即放入盛有37～40℃温水的搪瓷杯内（不要用玻璃烧杯，以防炸碎），并搅动以加速融化；③用乙醇消毒安瓿外表；④由于二甲基亚砜对细胞有一定的毒性，故应尽早去除，或将细胞立即离心，换上新鲜培养基，或先将细胞悬液直接种入培养瓶内（加10 mL培养基），放置4～6 h，待细胞贴壁后立即换液；⑤隔天观察细胞生长情况，再换液一次。

六、动物细胞大规模培养的方法

从生产实际看，动物细胞的大规模培养主要可分为悬浮培养、贴壁培养和贴壁-悬浮培养。

（1）悬浮培养　所谓悬浮培养，就是让细胞自由地悬浮于培养基内生长增殖。它适用于所有的非贴壁依赖型细胞（悬浮细胞），也适用于兼性贴壁细胞。该培养方法的优点是操作简便，培养条件比较均一，传质和传氧较好，容易扩大培养规模，在培养设备的设计和实际操作中可借鉴许多有关细菌发酵的经验。不足之处是由于细胞体积较小，较难采用灌流培养，因此细胞密度一般较低。

（2）贴壁培养　贴壁培养是必须让细胞贴附在某种基质上生长繁殖的培养方法。它适用于所有的贴壁依赖型细胞（贴壁细胞），也适用于兼性贴壁细胞。该方法的优点是适用的细胞种类广（因为生产中所使用的细胞绝大多数是贴壁细胞），较容易采用灌流培养的方式使细胞达到高密度；不足之处是操作比较麻烦，需要合适的贴附材料和足够的面积，培养条件不易均一，传质和传氧较差，这些不足常常成为扩大培养的“瓶颈”。生产疫苗中早期一般采用转瓶大量培养原代鸡胚或肾细胞。

（3）贴壁-悬浮培养（或称假悬浮培养）主要有微载体培养、包埋与微囊培养、结团培养。该培养方法弥补了贴壁培养的不足，它既提供贴壁细胞生长需要的贴附表面，又采用悬浮培养的培养方式，培养效果较好。

七、动物细胞培养的操作方式

无论是悬浮培养、贴壁培养还是贴壁-悬浮培养，其操作方式与培养细菌一样，一般可分为分批式操作、补料-分批（或流加式）操作、半连续式操作、连续式操作和灌流式操作。

八、动物细胞生物反应器

动物细胞生物反应器的作用是给动物细胞的生长代谢提供一个最优化的环境，从而使其在生长代谢过程中产生出最大量、最优质的所需产物。理想的动物细胞生物反应器必须具备以下一些基本要求：

（1）制造生物反应器所采用的一切材料，尤其是与培养基、细胞直接接触的材料，对细胞必须是无毒性的；

（2）生物反应器的结构必须使之具有良好的传质、传热和混合的性能；

（3）密封性能良好，可避免一切外来的微生物的污染；

（4）对培养环境中多种物理化学参数能自动检测和调节控制，控制的精确度高，而且能保持环境质量的均一；

（5）可长期连续运转，这对于培养动物细胞的生物反应器显得尤其重要；

（6）容器加工制造时要求内表面光滑，无死角，以减少细胞或微生物的沉积；

（7）拆装、连接和清洗方便，能耐高压蒸汽消毒，便于操作维修；

（8）设备成本尽可能低。

九、动物细胞产品的分离纯化方法

动物细胞产品的分离纯化方法包括离心、离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析、盐析和有机溶剂沉淀、透析、高效液相色谱等方法。

公式中之所以要乘以10000，是因为四角每一大格的面积为1 mm2，而盖片与计数板之间的间隙为0.1 mm深，故该区域内的液体量仅为0.1 mm3，要换算成每毫升细胞数就要扩大10000倍。

为了区别细胞的死活，在计数前可进行细胞染色。常用的染色液包括：①台盼蓝，细胞悬液与0.4%台盼蓝溶液按9∶1混匀，此时死细胞呈蓝色，计数时可分开；②苯胺黑，染色时细胞悬液和染液比同台盼蓝。

（三）细胞传代

无论是悬浮细胞还是贴壁细胞的培养，当细胞增殖到一定程度，由于各种因素，包括培养条件、代谢废物的浓度、pH，以及氧的供应等因素的限制，特别是许多贴壁生长的二倍体细胞都具有接触抑制的特性，因此细胞的密度不可能无限制增加。如不及时分种，细胞就会死亡、脱落。故在细胞的培养过程中需注意及时地传代。一般来说，二倍体只能传40～50代，而异倍体细胞可无限制地进行传代。

（1）悬浮细胞的传代　悬浮细胞的传代比较容易，只要加入一倍或几倍的生长液，然后分种两个或多个培养瓶即可。

（2）贴壁细胞的传代　贴壁细胞的传代需经消化液消化后再分种。在分种过程中需注意以下事项：①消化前需先用肉眼或显微镜下观察待消化的细胞，确认细胞有无污染，若怀疑有污染则去除；②加入的消化液量要适当，以摇动时能盖满单层细胞为度；③消化时间不宜过久，一般在室温静置2～5 min（也可在37℃下保温），当见细胞层出现麻布样网孔时，即可倒去消化液，初次操作时怕把握不好时机，可在显微镜下观察，当细胞分离变圆，即可停止消化，也可在加入消化液并轻轻摇动后即倒去消化液，靠少量残液继续作用；④终止消化时先要去掉消化液，然后加入有血清的培养基；⑤分种数量取决于细胞数和细胞特性，多数细胞分种以每毫升20万～30万个、每次1传2或1传3为好，有的细胞可分种得更多；⑥已培养过的瓶子可再次使用，但一般不要超过2～3次；⑦二倍体细胞培养时每次传代必须写上传代次数；⑧传代后一般每天或隔天换液，每3～5 d就要传代一次。

（四）细胞的冻存和复苏

（1）细胞的冻存　保存细胞都采用液氮低温（-196℃）冻存的方法。为了防止电解质过分浓缩，可采用某些保护剂，如甘油和二甲基亚砜。在冷冻时，冷冻速度很重要，不能太快，也不能太慢。太慢会产生冰晶损伤细胞，太快则不足以使水分排出。一般以1℃/min的速度下降为宜。在无定速降温设备时，可按以下三种方法之一处理：①将安瓿放在壁厚为1.5 cm的聚乙烯盒内，然后放在-70℃冰箱内2 h，再转入液氮；②先将安瓿置于冰箱中4～5 h或过夜，再移至-70℃冰箱内2 h，然后悬于液氮罐颈口1 h，最后浸入液氮；③放在冻存简易装置内，置于液氮罐颈口，离液氮面5～10 cm，2～3 h后浸入液氮。

（2）细胞的复苏　复苏时，总的要求是快融。在实际操作中需注意以下几点：①为了防止因玻璃安瓿封口不好，在融化时渗入的液氮引起安瓿爆炸，在操作中要注意防护，戴面罩和手套；②从液氮罐取出的安瓿应立即放入盛有37～40℃温水的搪瓷杯内（不要用玻璃烧杯，以防炸碎），并搅动以加速融化；③用乙醇消毒安瓿外表；④由于二甲基亚砜对细胞有一定的毒性，故应尽早去除，或将细胞立即离心，换上新鲜培养基，或先将细胞悬液直接种入培养瓶内（加10 mL培养基），放置4～6 h，待细胞贴壁后立即换液；⑤隔天观察细胞生长情况，再换液一次。

六、动物细胞大规模培养的方法

从生产实际看，动物细胞的大规模培养主要可分为悬浮培养、贴壁培养和贴壁-悬浮培养。

（1）悬浮培养　所谓悬浮培养，就是让细胞自由地悬浮于培养基内生长增殖。它适用于所有的非贴壁依赖型细胞（悬浮细胞），也适用于兼性贴壁细胞。该培养方法的优点是操作简便，培养条件比较均一，传质和传氧较好，容易扩大培养规模，在培养设备的设计和实际操作中可借鉴许多有关细菌发酵的经验。不足之处是由于细胞体积较小，较难采用灌流培养，因此细胞密度一般较低。

（2）贴壁培养　贴壁培养是必须让细胞贴附在某种基质上生长繁殖的培养方法。它适用于所有的贴壁依赖型细胞（贴壁细胞），也适用于兼性贴壁细胞。该方法的优点是适用的细胞种类广（因为生产中所使用的细胞绝大多数是贴壁细胞），较容易采用灌流培养的方式使细胞达到高密度；不足之处是操作比较麻烦，需要合适的贴附材料和足够的面积，培养条件不易均一，传质和传氧较差，这些不足常常成为扩大培养的“瓶颈”。生产疫苗中早期一般采用转瓶大量培养原代鸡胚或肾细胞。

（3）贴壁-悬浮培养（或称假悬浮培养）主要有微载体培养、包埋与微囊培养、结团培养。该培养方法弥补了贴壁培养的不足，它既提供贴壁细胞生长需要的贴附表面，又采用悬浮培养的培养方式，培养效果较好。

七、动物细胞培养的操作方式

无论是悬浮培养、贴壁培养还是贴壁-悬浮培养，其操作方式与培养细菌一样，一般可分为分批式操作、补料-分批（或流加式）操作、半连续式操作、连续式操作和灌流式操作。

八、动物细胞生物反应器

动物细胞生物反应器的作用是给动物细胞的生长代谢提供一个最优化的环境，从而使其在生长代谢过程中产生出最大量、最优质的所需产物。理想的动物细胞生物反应器必须具备以下一些基本要求：

（1）制造生物反应器所采用的一切材料，尤其是与培养基、细胞直接接触的材料，对细胞必须是无毒性的；

（2）生物反应器的结构必须使之具有良好的传质、传热和混合的性能；

（3）密封性能良好，可避免一切外来的微生物的污染；

（4）对培养环境中多种物理化学参数能自动检测和调节控制，控制的精确度高，而且能保持环境质量的均一；

（5）可长期连续运转，这对于培养动物细胞的生物反应器显得尤其重要；

（6）容器加工制造时要求内表面光滑，无死角，以减少细胞或微生物的沉积；

（7）拆装、连接和清洗方便，能耐高压蒸汽消毒，便于操作维修；

（8）设备成本尽可能低。

九、动物细胞产品的分离纯化方法

动物细胞产品的分离纯化方法包括离心、离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析、盐析和有机溶剂沉淀、透析、高效液相色谱等方法。