它是从应用的目的出发研究酶、应用酶的特异催化功能，并通过工程化将相应原料转化成有用物质的技术。......
2023-06-24
深入了解基因工程制药技术
【摘要】：基因工程又可称为重组DNA技术、分子克隆技术、基因的无性繁殖、基因操作、基因克隆技术。（三）基因工程载体能够将外源DNA载入宿主细胞进行复制、整合或表达的工具称为载体。基因工程载体按照其用途大致可分为克隆载体和表达载体。目前克隆载体主要有质粒、噬菌体、柯斯质粒及人工染色体等。
一、基因工程基本知识
（一）基因和基因工程的概念
基因是指携带遗传信息的DNA序列，是控制遗传性状的基本单位。染色体在体细胞中是成对存在的，每条染色体上都带有一定数量的基因（见图1-1-1）。
图1-1-1 染色体基因示意图
基因工程是指在分子水平上按照人们的设计方案将DNA片段（目的基因）插入载体DNA分子（如病毒、质粒等），从而实现DNA分子体外重组，然后将之导入特定的宿主细胞进行扩增和表达，使宿主细胞获得新的遗传性状的技术。基因工程又可称为重组DNA技术、分子克隆技术、基因的无性繁殖、基因操作、基因克隆技术（见图1-1-2）。
图1-1-2 重组DNA示意图
（二）基因工程的主要工具酶
基因工程的操作是分子水平上的操作，为了获得需要重组和能够重组的DNA片段，需要一些重要的酶，如限制性内切酶、DNA连接酶、DNA聚合酶等，以这些酶为工具对基因进行人工切割和拼接等操作，所以称其为工具酶。
（1）限制性内切酶 限制性内切酶能特异结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链DNA。DNA纯度、缓冲液、温度及DNA分子结构都会影响它的活性。
（2）DNA连接酶 基因工程最常用的连接酶是T4 DNA连接酶，该酶是从T4噬菌体感染的大肠杆菌（E.coli）中分离得到的单链多肽酶，它在有ATP作为辅助因子时可催化一个DNA片段的3'-羟基和另一个DNA片段的5'-磷酸基团之间形成磷酸二酯键的反应，从而将两条DNA分子拼接起来。它既可催化黏性末端间的连接，又可有效地将平末端DNA片段连接起来，是应用最广泛的连接酶。T4 DNA连接酶最适反应温度为37℃，但为了增强DNA片段黏性末端互补碱基之间形成氢键的稳定性，实际反应温度一般为4～15℃。
（3）DNA聚合酶 DNA聚合酶能在有模板存在时催化合成与模板序列互补的DNA产物。常用的DNA聚合酶有大肠杆菌聚合酶、大肠杆菌聚合酶大片段（Klenow片段）、T4 DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶、耐高温的DNA聚合酶（如Taq DNA聚合酶）、反转录酶等。不同种类的DNA聚合酶来源不同，酶学特性及用途也各异，其应用涉及DNA分子的体外合成、定点突变、DNA探针的标记、DNA序列测定、基因文库的构建、聚合酶链反应（PCR）等诸多方面。
（三）基因工程载体
能够将外源DNA载入宿主细胞进行复制、整合或表达的工具称为载体。载体的本质是DNA，它能够在宿主细胞中进行自我复制和表达。基因工程载体按照其用途大致可分为克隆载体和表达载体。
（1）克隆载体 克隆载体适用于外源基因在受体细胞中复制扩增。目前克隆载体主要有质粒、噬菌体、柯斯质粒及人工染色体等。质粒是一种存在于染色体外能自主复制的遗传因子，为闭合环状双链DNA分子，以超螺旋状态存在于宿主细胞中（见图1-1-3）。
图1-1-3 质粒载体的基本结构
为了适应实验室操作，需在天然质粒的基础上人工构建质粒载体。常用的质粒载体大小一般在1～10 kb，如pBR322、pUC系列（见图1-1-4）、pGEM系列和pBS等。质粒载体通常带有1个或1个以上的选择性标记基因（如抗生素抗性基因）和1个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列，并去掉了大部分非必需序列，使分子尽可能减少，以便于基因工程操作。
图1-1-4 pUC18/19质粒图谱
（2）表达载体 表达载体适用于在受体细胞中表达外源基因，它带有表达构件——转录和翻译所需的DNA序列，如大肠杆菌表达载体含启动子、核糖体结合位点、克隆位点、转录终止序列等。启动子标志基因转录应该起始的位点，是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合的并能启动mRNA合成的序列。常用的启动子有trp-lac（tac）启动子、λ噬菌体pL启动子、T7噬菌体启动子等。大肠杆菌mRNA的核糖体结合位点是SD序列（位于起始密码子AUG上游3～10 bp处的3～9 bp长富含嘌呤核苷酸的序列）。转录终止序列（转录终止子）是能够被RNA聚合酶识别并停止转录的DNA序列。
（四）基因工程的应用
基因工程的应用包括转基因动物、转基因植物、基因工程药物、基因诊断与基因治疗、基因环境监测与净化，以及基因工程的工业应用。
二、基因工程药物
基因工程药物是指先确定对某种疾病具有预防和治疗作用的蛋白质，然后将该蛋白质的基因分离、纯化或进行人工合成，利用重组DNA技术加以改造，最后将该基因放入可以大量生产的受体细胞中繁殖，并能大规模生产具有预防和治疗该种疾病的蛋白质，通过这种方法生产的新型药物。
基因工程技术的应用使得人们在治疗癌症、病毒性疾病、心血管疾病和内分泌疾病等方面取得了明显的效果。这些药物和制剂都是很珍贵的，用传统方法难以大规模生产，主要包括激素类、细胞因子、酶类、基因工程可溶性受体、基因工程抗体。
三、基因工程药物生产的基本过程
基因工程药物生产的主要程序如下：获取目的基因；构建DNA重组体；将DNA重组体转入宿主菌构建工程菌；工程菌的发酵；外源基因表达产物的分离纯化；产品的检验等。以上程序中的每个阶段都包含若干细致的步骤，这些程序和步骤将会随生产条件的不同而有所改变。
通常将基因工程药物的生产分为上游阶段和下游阶段。上游阶段是研究开发必不可少的基础，主要是分离目的基因、构建工程菌（细胞）。获得目的基因后，最主要的就是目的基因的表达。选择基因表达系统时主要考虑的是保证表达的蛋白质的功能，其次是表达的量和分离纯化的难易。下游阶段是从工程菌的大量培养一直到产品的分离纯化和质量控制。此阶段主要包括工程菌大规模发酵最佳参数的确立、新型生物反应器的研制、高效分离介质及装置的开发、分离纯化的优化控制、高纯度产品的制备技术等。
（一）获取目的基因
目前应用较多的基本方法包括：直接法，即直接从染色体中分离目的基因；构建基因组DNA文库或cDNA文库，从中筛选目的基因；人工化学合成法；PCR法扩增目的基因等。
（二）构建DNA重组体
目的基因需要载体的运载才能进入宿主细胞，常用的基因载体有质粒（如pBR322、pUC）、噬菌体（如λ噬菌体、M13噬菌体）和病毒载体等，利用限制性内切酶和其他一些酶类对载体DNA和目的基因进行切割和修饰，并用T4 DNA连接酶等连接起来，使目的基因插入可以自我复制的载体内，形成DNA重组体。根据目的基因片段的来源与类型不同，使用不同的连接方法，目前应用较多的连接方法有3种：黏性末端连接、平末端连接和TA克隆。
（三）DNA重组体转入宿主菌
DNA重组分子在体外构建完成后必须导入受体细胞中才能使外源目的基因得以大量扩增或表达，受体细胞（又称宿主细胞）包括原核受体细胞（主要是大肠杆菌）、酵母菌和动物细胞等。DNA重组分子导入宿主菌的过程及操作称为重组DNA分子的转化。通过转化接受了外源DNA的细胞称为转化子，接受转化作用的生理状态称为感受态。目前常用的诱导感受态转化的方法是CaCl2法。Ca2+处理的感受态细胞一般每微克DNA可获得107～108个转化子。除化学法转化细菌外，还可采用高压脉冲电击转化法，依靠短暂的电击，促使DNA进入细菌。
（四）筛选与鉴定阳性克隆
菌落筛选的方法主要有插入失活双抗生素对照筛选和插入失活基因的蓝白斑筛选，也可用核酸杂交的方法进行菌落筛选。鉴定的方法有多种，一般可用酶切或PCR初步鉴定，必要时对插入片段进行测序作最终鉴定。
（五）基因表达
目前使用广泛的宿主主要是大肠杆菌和酿酒酵母。
（六）基因工程菌发酵
基因工程菌构建成功后，即可通过大规模培养获得大量的表达产物。基因工程菌的培养过程主要包括：①通过摇瓶操作了解工程菌生长的基础条件，分析表达产物的合成、积累对受体细胞的影响；②通过培养罐操作确定培养参数和控制的方案。
（1）基因工程菌的培养方式 包括补料分批培养、连续培养、透析培养、固定化培养。
（2）基因工程菌的发酵工艺 基因工程菌培养是为了使外源基因大量表达，尽可能减少宿主细胞本身蛋白质污染，外源基因高效表达，不仅涉及宿主、载体和克隆基因之间的相互关系，而且与其所处的环境密切相关。发酵条件不同，代谢途径也可能发生变化，对下游纯化工艺就会造成影响。
（3）基因工程菌的控制 基因工程菌在传代过程中经常出现质粒不稳定的现象，常见的是分裂不稳定，指的是基因工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象。在培养基中加入选择性压力（如抗生素等），以抑制质粒丢失菌生长，也是基因工程菌培养中提高质粒稳定性的常用方法。
基因工程菌逃逸后将给自然界带来不可预料的后果，因此，培养液要经过化学处理或热处理后才可排放，发酵罐排气口要用蒸汽灭菌或微孔滤器除菌后，才可以放出废气。
（七）基因工程药物的分离纯化
分离纯化是基因工程药物生产中极其重要的一环，这是由于基因工程菌经过大规模培养后，产生的有效成分含量很低，杂质含量却很高；另外，由于基因工程药物是由转化细胞生产的，而不是正常普通细胞生产的，所以对产品的纯度要求也高于传统产品。要得到符合医用要求的基因工程药物，其分离纯化要比传统产品困难得多。
基因工程药物分离纯化包括细胞破碎、固液分离、浓缩与初步纯化、高度纯化直至加工得到纯品。其一般流程如图1-1-5所示。
图1-1-5 基因工程药物分离纯化的一般流程
（八）基因工程药物的质量控制
基因工程药物的质量控制主要包括以下几个方面。①原料的质量控制：主要是对目的基因、表达载体及宿主细胞的来源、出处，基因的序列、克隆载体和表达载体的名称结构等都要非常清楚。使用它们时要制定严格要求，否则无从保证产品质量的安全性和一致性，并可能产生不利的遗传诱变产物。②培养过程的质量控制：无论是发酵还是细胞生产，关键是保证基因的稳定性、一致性和不被污染。主要控制有限代次的生产和连续培养过程。③纯化工艺过程的质量控制：要求能保证去除微量DNA、糖类、残余宿主蛋白质、纯化过程带入的有害化学物质、热原，或者将这类杂质减少至允许范围以内。④目标产品的质量控制：产品的鉴别、纯度、活性、安全性、稳定性、一致性。⑤产品的保存。
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