时间分辨光谱测量技术分析与应用

2023-06-20 理论教育版权反馈

【摘要】：图7-3单光子计数法荧光时间分辨测量仪器时间分辨率是荧光寿命测量仪器的重要参数，它决定了仪器所能测量到的最短荧光寿命。在时间分辨荧光光谱仪中，无论是脉冲法或相移法，时间分辨率都是由激发光源与检测器共同决定的。但其时间分辨率比单光子计数法差，而且测量低荧光强度的样品时难度较大。

1.原理与方法

时间分辨光谱是一种瞬态光谱，是激发光脉冲截止后相对于激发光脉冲的不同延迟时刻测得的荧光发射，反映了激发态电子的运动过程（即荧光动力学）。一般测量的是荧光衰减谱，即固定检测所用的激发波长λex和发射波长λem，记录荧光强度随时间的变化趋势。通常可采用两种时间分辨技术实现这一测量：基于时域的脉冲法与基于频域的相移法。

脉冲法采用很短的脉冲光源，而相移法采用可以给出各种频率简谐波的调制光源。两者得到的信号虽然都如式（7-7）所示，为激发光与δ脉冲响应卷积的结果。但很显然，由于激发光源的不同，两者得到的信号有很大的差别。脉冲法得到的荧光发射强度先增加，达到峰值后开始逐渐衰减（见图7-2），当激发光的强度可以忽略后，衰减情况就变得与δ脉冲响应的衰减曲线I（t）一致。因此，若要得到真实的δ脉冲响应参数，需要对测量得到的荧光信号进行去卷积的运算。

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图7-2　荧光时间分辨技术中的激发与响应信号转换［3］

相移法的激发光源为正（余）弦函数形状的简谐波，它与I（t）的卷积结果仍为一个正（余）弦函数，且激发光与信号光的频率一致，只存在相位上的差别，以及平衡位置与幅度上的变化。相位上的变化用相移Φ表示，而平衡位置与幅度上的变化则用调制因子M表示（其中M=m／m0，具体见图7-2）。由于这些参数都可以直接通过激发光与信号光的比较来获得，因此相移法不需要通过去卷积的手段来获得数据。

2.脉冲法的测量与仪器

在目前针对荧光寿命或荧光衰减的检测中，脉冲法是最常使用的技术，其中单光子计数法（time-correlated single-photon counting，TCSPC）是较普遍使用的手段。单光子计数法的基本原理是，在某一时间t检测到发射光子的概率，与该时间点的荧光强度成正比。令每一个激发脉冲最多只得到一个荧光发射光子，记录该光子出现的时间，并在坐标上记录频次，经过大量的累计，即可构建出荧光发射光子在时间轴上的分布概率曲线，即荧光衰减曲线。该过程类似于在光的衍射中，让一个个单一的光子经过狭缝，即可累计出衍射图像。单光子计数法仪器示意图（如图7-3所示），其中一个重要的部件被称作时幅转换器（TAC），它可以将两个电信号间的时间间隔长度记录下来。激发光源发射一束短的脉冲光，同时被转换为一个电信号，启动TAC的记录；样品被脉冲光激发后，放出的光子同样被转换为一个电信号，终止TAC的记录。这样被TAC记录下来的时间间隔信号会以电脉冲的形式传达给多通道分析器（MCA），并在MCA对应的时间通道内记录一个点。经过大量的累计，就会形成荧光衰减曲线。计数越多，得到的曲线的精确度就越高，通常衰减曲线的峰值计数要达到103～104个左右。另外，如果需要对所测曲线解卷积，就需要记录激发脉冲的曲线形状。这时，只要在相同的检测条件下，将样品换作光散射的溶液即可。

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图7-3　单光子计数法荧光时间分辨测量仪器

时间分辨率是荧光寿命测量仪器的重要参数，它决定了仪器所能测量到的最短荧光寿命。在时间分辨荧光光谱仪中，无论是脉冲法或相移法，时间分辨率都是由激发光源与检测器共同决定的。在TCSPC法中，激发光源的选择非常重要，既可以选用各种气体闪光灯，也可选用脉冲激光器。闪光灯的成本相对较低，给出的脉冲基本在纳秒级，脉冲频率不高，大概为104～105 Hz，因此数据采集时间较长，在测定过程中还可能出现光强度漂移的情况，影响测量的效率与准确性。脉冲激光器则可以给出皮秒级的脉冲，且脉冲频率非常高，但是其价格也比较昂贵。检测器方面，一般采用光电倍增管（PMT），也可采用微通道板检测器（MCP），后者的响应时间更短，且抗干扰能力强。采用脉冲激光器与MCP的仪器，理论上可以检测到10～20 ps的荧光寿命。

除了TCSPC法之外，频闪技术也用于脉冲法。该方法的激发光源同样是一连串的脉冲光，但是通过控制PMT的检测时间范围，每次只测量特定时间段内的荧光强度，即将衰减曲线分割为许多小段进行测量，最后再拼合起来。这样的测量方法避免了使用昂贵的部件，因为数据采集相对迅速，所以不需要使用高频率的闪光灯或激光器。但其时间分辨率比单光子计数法差，而且测量低荧光强度的样品时难度较大。

TCSPC法具有灵敏度高，动力学线性响应范围宽，统计学参数明确等优势。但由于TAC只记录激发脉冲后的第一个发射光信号，如果某一个激发脉冲产生了两个发射光子，则只有第一个光子会被记录下来，这样得到的荧光曲线会扭曲，使短时间处的信号频次堆积得偏高，这被称为“堆积效应”。因此，必须控制发射光的脉冲数，使其远远小于激发光的脉冲数，一般比例要小于0.01～0.05，这意味着大量的分子是通过非辐射的方式去活的，这种情况下一束脉冲光发射出多个光子的概率很小。但这也意味着计数频率非常低，需要相当长时间的计数才能满足准确测量的要求，因此TCSPC法耗时较长。另外，对测量结果解卷积的过程也容易引进误差，特别是对于荧光寿命较短的体系。

时间分辨光谱测量技术分析与应用

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