直链淀粉含量检测在水稻品质育种中的重要性

直链淀粉含量是评价稻米蒸煮食味品质的一个重要指标，所以检测稻米的直链淀粉含量是水稻品质育种的基本工作。直链淀粉是D-葡萄糖基以α-1，4糖苷键连接的多糖链，分子中有200个葡萄糖基，分子量1～2，聚合度990，空间构象卷曲成螺旋形，每一回转为6个葡萄糖基。基本不分支，或分支很少。直链淀粉分子存在于淀粉的结晶区和无定形区。淀粉遇碘呈颜色反应，直链淀粉为蓝色，支链淀粉为紫红色。

自1970年首次提出碘比色法测定稻米直链淀粉含量值（Amylose Content，AC）以来，稻米AC测定技术有了突飞猛进的发展。对单波长比色法进行改进，提出了双波长比色法和多波长比色法，进一步发展出基于碘比色法的一系列新测定技术，如碘亲和力测定法、伴刀豆球蛋白法、自动分析检测仪。采用比较多的是标准碘蓝比色法（也称“常规法”），待测样本需要经过出糙、精白、粉碎等一系列破坏性前处理。经过处理后的水稻样品不能继续种植，而且操作步骤繁琐、测试周期长，无法满足育种工作者对早代进行筛选的要求。一些学者利用稻米理化特性，引进了新的检测仪器，开发出近红外光谱分析法、高光谱法、RVA快速黏度分析法等检测手段；基于分子基团特性，开发出色谱分析法、差示扫描量热法、非对称流场流分离技术等。

如今直链淀粉检测仪是专业用于测定农作物中的直链淀粉含量。其中，采用激光光源的直链淀粉分析仪，CCD稻谷外观品质图像分析与识别软件系统，属创新性成果，填补了我国仪器仪表在稻谷品质测试领域的空白，为国内首创，属国际先进水平。DPCZ-II直链淀粉检测仪已通过农业部谷物品质监督检验测试中心的检验，在大米、玉米、小麦等农作物中应用广泛。

国外对直链淀粉的研究较早，尤其是美国，我国对直链淀粉的研究较晚，差距较大。目前对于玉米中直链淀粉含量和应用的测定较多，测定食物中直链淀粉的含量对我们了解食物特性起到很大作用，以下是测定食物中直链淀粉含量的方法。

1.波长比色法

（1）单波长比色法：

①标准法：单波长比色法是国际上认可的测定AC值的标准方法。目前，我国推荐测定稻米AC值的标准方法有3种，即国际标准ISO6647－2—2007《稻米直链淀粉含量测定第2部分常规方法》、国家标准GB/T15683—2008《大米直链淀粉含量的测定》、农业部标准NY/T83—1988《米质测定方法》。这3种标准方法的区别在于样品和标样是否进行脱脂处理，脱脂后的静置时间。国标法要求脱脂并静置2 d，耗时最长。吴秋婷等发现脱脂处理的AC值显著高于未脱脂处理的测定值，不脱脂和脱脂处理之间AC测定值可用“0.89”比值进行转换。标准方法的主要技术局限性是前处理较麻烦，操作步骤较繁锁，技术性要求较高。

②简易测定法：简易测定法是在标准法的基础上，经技术简化与改进而来的，基本原理与标准法相同。如对农业部标准（NY147－1988）进行简化，以10 mg样品代替了标准中的50 mg样品，所用的试剂也相应按比例减少。梅淑芳等（2007年）报道了农业部标准简易测定法，以梯度化AC的稻米样品进行简化测定方法的可靠性验证，并与农业部标准测定值相比较，结果简易法测定值与标准法测定值呈高度正相关（r=0.9 996），两种方法测定值之间的绝对误差小于1.2%。与标准法相比较，简易法具有简单易操作、样品量少等优点。

（2）双波长比色法：双波长比色法与单波长比色法相比，不同点在于分光光度计测定时选用了2个波长测定吸收值，因而可以同时测出直链淀粉和支链淀粉的含量。原理是利用溶液中某溶质对2个波长的吸光度差值与溶质浓度成正比，测定吸光度差值，可消减两类淀粉吸收背景的相互影响，因此，提高了测定的灵敏度和选择性。双波长法测定前需要绘制Am和Ap的标准曲线。戴双等（2008年）用单波长法和双波长法测定小麦的AC，结果双波长法优于单波长法。范明顺等（2008年）以高粱为样品，用双波长法测定两类淀粉含量，结果显示，双波长法的重现性较好，相对标准偏差小于1%。双波长比色法可以有效克服因长链Ap与碘形成的络合物，吸收光谱波长接近于Am-碘络合物的吸收波长，从而导致所测定的 AC 比真实值偏高的缺点，测定结果更为准确。双波长法可以同时获得总淀粉、Am和Ap含量3个指标，工作效率高，缺点是需同时制备两类淀粉的标准曲线。

（3）多波长比色法：多波长比色法在比色时需测定3个或以上波长的吸收值。据报道，可同时测定Am、Ap和总淀粉含量的三波长比色法，结果更精确。由于所用的波长数目多，结果计算公式非常复杂。戴双等（2008年）对单波长法、双波长法和多波长法的比较表明，多波长法测定复杂、计算繁琐，认为双波长法更适于同时测定Am和Ap含量。

2.基于碘比色法衍生的检测方法

基于碘比色法衍生的检测方法，不仅是标准方法，常用的AC测定方法都是利用直链淀粉与碘形成络合物的呈色反应。随着科学技术的发展，会在碘比色法的基础上，结合运用其他物理学或化学技术，创新衍生出新方法。

（1）碘亲和力滴定法：碘亲和力滴定法是在测定过程中用电物理学滴 定代替了光比色技术。该方法包括安培滴定法和电位滴定法，原理是利用在碘与淀粉形成络合物期间电化学性质（如电位/电流可发生变化），对照先前绘制的标准曲线，推算出与碘结合的淀粉量。陈俊芳等（2010年）以稻米为材料，比较碘比色法和电位滴定法测定Am和Ap，结果电位滴定法直线回归方程的相关系数更加接近l，测定结果的稳定性、重复性更好。由此可见，电位滴定法具有简便、快速、准确的优点，采用多函数拟合绘制的工作曲线，获得的数据更精确、重复性更高。

（2）横切浸染法：Agasimani等（2013年）报道了一种简单快速的单籽粒AC测定的横切侵染法。对低AC（10%～20%）、中AC（20%～25%）和高AC（＞25%）的三类样品，用刀片横切成熟的籽粒中部，在横切面上滴KI-I，淀粉与碘液发生染色反应，染色呈放射状扩散。这一扩散过程所需的时间因样品而不同，通过测定已知AC标准样品的碘浸染扩散所需时间，建立扩散时间与AC的计算表，可以估测出待测样的AC值。Avaro等（2009年）报道了用碘染色判断稻米AC的简易测定方法，前面的步骤与标准法相近，不同的是省去了分光光度计比色这一步，而是用自制的比色卡来粗略判断AC值。王跃星等报道了另一种与此方法原理相同的推测AC值范围研究，采用磨粉糊化后进行简易碘蓝染色，根据染色程度推测稻米的AC值，分别在马铃薯、豌豆、高粱、大麦AC检测方面开发了基于碘比色法的简易测定法。

（3）伴刀豆球蛋白法（Concanavalin A Method，Con A Method）：主要是利用支链淀粉可与Con A生成络合物，而直链淀粉不能与Con A生成络合物这一特性，开发出来的一种新AC测定法。经脱脂处理的稻米粉溶液在特定的温度、pH和离子强度下，加入一定量的Con A，Con A与支链淀粉形成络合物。离心除去沉淀的络合物。加入α-淀粉酶/葡萄糖淀粉酶水解上清液中的直链淀粉，形成葡萄糖。同时将另一份独立的脱脂米粉溶液样本，直接加入α-淀粉酶/葡萄糖淀粉酶，水解成葡萄糖。最后用碘比色法测定两份样品中葡萄糖的含量，计算出直链淀粉和总淀粉含量，差值为支链淀粉含量。该法最早由Yun等（1990年）和Matheson等（1990年）提出，后经Gibson等（1997年）对试验操作过程进行了改进。Gibson等（1997年）验证Con A法与碘比色法所测定值的相关系数达0.933，结果的相对标准差（RSD）小于5%，米粉样品则小于10%。Con A法的优点是不需要校准曲线，准确性高，无需昂贵仪器和预纯化过程，可以测定脱脂处理的米粉或纯淀粉样品。目前市场上有商品化的试剂盒出售，如Megazyme直链淀粉试剂盒。

（4）自动分析检测法：自动分析检测法是基于碘比色法，运用自动控制技术、信息技术、人工智能技术等研发的仪器，分析检测代替了人工操作与计算。自动分析检测仪是农作物品质鉴定的专用仪器。国外研究起步较早，已陆续推出有商业价值的一系列自动分析检测仪，如法国Alliance公司研制的FuturaⅡ全自动连续流动分析仪、荷兰Skalar仪器公司的Skalarsan+化学自动分析仪、瑞典Foss公司的FIA star5000型直链淀粉自动分析仪。这些仪器性能可靠、智能化程度高，但价格比较昂贵。在国内，研制测定自动分析检测仪的工作相对较晚。张巧杰等（2005年）设计了一种类似的仪器，稳定性较好，目前已有中国农业大学研制的DPCZ－2型直链淀粉测定仪在商业化销售，很好地结合了计算机技术和分光光度技术，可以用于小麦、玉米、大米等多种谷物的AC快速测定。刘卫国等（2009年）、倪小英等（2009年）分别比较了自动分析仪与国标法检测的AC值结果，相对标准偏差1.9%，表明自动分析检测法具有很好的可靠性和可重复性。目前这一技术主要被专业的检测机构使用。

3.基于理化特性的新检测方法

（1）近红外光谱分析法：近红外光谱分析法（Near Infrared Reflectance Spectroscopy，NIRS）是近年来兴起的一种定量分析技术，最大的优点是无损检测。刘建学等（2000年）用近红外光谱对不同粒度、不同类型的大米进行检测，建立了稻米AC的检测模型，结果表明，对精米样品检测值与化学分析值的相关系数高达0.95。陈峰等（2009年）利用近红外透射分析法（NTTS）和化学法测定了54个水稻表观AC，两种方法的相关系数为0.68。彭建等（2010年）也得到了类似的结果。NIRS对禾谷类种子的无损检测具有开创性的意义，对农作物品质育种研究尤其重要，但NIRS测定之前需要建模，所建模的优劣直接决定了测定结果的准确性，而且各机器间所建的模块不能相互通用，因此，需要耗费较大的人力和物力。

（2）高光谱分析法：利用高光谱遥感技术测定或监测作物生化组分或品质，是一项正在熟化的新技术。利用作物生化组分对0.4～2.4 μm光谱的吸收有微弱差异，可以直接进行生化组分的定量分析。刘芸等（2008年）用高光谱仪扫描籼稻、粳稻和杂交稻米粉样品的反射光谱，经计算证实了原始光谱反射率和一阶导数光谱与米粉的粗蛋白质、粗淀粉和AC存在相关性，以相关系数较大的光谱变量建立AC的估算数学模型，检验精度在82.5%～94.9%。薛利红等（2004年）测定不同生育期水稻冠层高光谱反射率与总淀粉和AC的相关性，结果存在显著或极显著相关，总淀粉含量在灌浆盛期的近红外波段达到了显著水平（r＞0.74）。谢晓金等（2012年）进一步测定并建立了粗蛋白含量和AC的监测模型，运用独立数据检验模型准确度为0.708～0.923。高光谱遥感技术在农作物的品质监测中具有明显优势，可以快速、低成本地检测稻米品质，发展与利用前景十分看好。

（3）快速黏度分析法：早期开发出Brabender黏滞淀粉谱仪，可测定米粉黏滞淀粉谱，后经改良推出快速黏度分析仪（Rapid Viscosity Analyzer，RVA），并于20世纪末引入稻米品质测定。RVA可测定米糊的峰值黏度、热浆黏度、冷胶黏度、崩解值、消减值、回复值、峰值时间、起浆温度等特征值，这些特征值与稻米的外观品质、蒸煮品质和营养品质存在内在关联，因此，可以预测或判定稻米品质的优劣。李刚等（2009年）测定了106份水稻RVA谱的特征值与外观品质、蒸煮品质的相关性，结果崩解值和消减值与垩白米率的相关系数为-0.43和0.40，低AC品种和糯性品种的AC值与RVA谱特征值相关，糯性品种的相关系数达0.87～0.99。隋炯明等（2005年）分析了215水稻RVA谱特征值与品质的相关性，发现表观直链淀粉含量（ACC）与8项RVA谱特征值均呈显著或极显著相关。胡培松等（2004年）利用此技术测定了稻米样品，分析结果发现，AC、GC与RVA谱的6个特征值相关最明显，相关系数在0.9以上。这些结果表明，利用RVA特征值与AC或AAC的存在关联性，利用线性回归定量分析模型可开发出AC预测模型。利用RVA仪预测AC有很大的技术优势，具有样品用量少、测定时间短、可重复性高的优点，可以预测垩白率、胶稠度、糊化温度等蒸煮品质，最终给出样品的食味评价，因此，应用前景十分广阔，非常适合品种选育和大批量样品的快速测定。

4.基于分子基团特性的新检测方法

（1）体积排阻色谱法体积排阻色谱法（Size Exclusion Chromatography，SEC）：又叫凝胶渗透色谱法。原理是利用Am的最小相对分子质量（一般在几万到几百万），Ap的相对分子质量最大（几百万到几亿），中间级分是介于Am和Ap之间的多糖成分。当淀粉在进入凝胶色谱后，会依据分子质量的不同，进入或不进入固定相凝胶的孔隙中。支链淀粉分子质量大，不能进入凝胶孔隙的分子，会很快随流动相洗脱；能够进入凝胶孔隙的直链淀粉，则需要更长时间的冲洗才能够流出固定相，从而实现对Am和Ap的分离。将淀粉样品通过体积排阻色谱柱，得到3个峰，分别代表Am、中间级组分和Ap。根据色谱图面积推算出各种淀粉的含量。蔡一霞等（2006年）用Sephadex G75层析柱分析了稻米中支链淀粉分枝链的链长分配，经分离获得的FrⅠ部分的链长平均聚合度＞100 GU（glucose unite），FrⅡ部分的链长的平均聚合度为44～47 GU，FrⅢ部分的链长平均聚合度为10～17 GU。Zhong等采用二甲亚砜等复配溶剂溶解稻米淀粉，经体SEC-多角度激光光散射法，分析稻米总淀粉、直链淀粉和支链淀粉的均重分子质量（Mw），结果直链淀粉的Mw为300万，支链淀粉的Mw为4 000万～5 000万。杨小雨等（2013年）建立了稻米支链淀粉链长相对分子质量分布的HPSEC分析方法，并测定了稻米支链淀粉的相对分子质量分布，结果表明，该方法数据可靠、重复性好、简单易行。体积排阻色谱法具有操作简单、速度快、效率高、准确度高、无污染的优点，也可用于中间级组分的定性定量研究。

（2）流场流分级法场流分离技术（Field Flow Fractionation，FFF）：是一项可分离、提纯和收集流体中悬浮物微粒的系列技术。液相中的场流分级即流场流分级（Flow Field-Flow Fractionation，FIFFF），是利用样品的质量、体积、扩散系数、电荷等物理特性上的差异，将流体和外场分离，利用分离物质的特异性质确定样品颗粒粒径及分布、分子质量。FIFFF技术与SEC技术原理相似，对分离超高分子质量聚合物更具优点，能最大限度地减少大分子的降解或吸附；与SEC相比，FIFFF适用的分子质量范围更广，可以相对容易地调整流量、磁场强度等控制分离范围、分辨率和分析时间。

（3）差示扫描量热法差示扫描量热法（Differential Scanning Calorimetry，DSC）：测定AC的原理是，溶血磷脂酰胆碱的极性端基团与淀粉的螺旋形结构相互作用产生络合物，该络合物所形成的放热曲线与淀粉中的AC成比例。目前使用的DSC设备都配置有自动取样装置，可进行自动分析，方法操作简单，应用便利。Polaske等（2005年）对5种AC的玉米淀粉样品，分别采用DSC法和碘比色法测定AC值，结果表明，两种方法测定值的相关系数达0.99，相关性很好。