淀粉脱分支酶基因在水稻淀粉合成中的作用

2023-06-20 理论教育版权反馈

【摘要】：水稻淀粉脱分支酶分为两类，即异淀粉酶、普鲁蓝酶或称极限糊精酶。目前，已知淀粉脱分支酶的同工型基因主要有3个异淀粉酶基因、1个糊精酶基因或称R酶基因。在水稻、玉米Sug1突变体胚乳中dbe的缺失，会造成PUL或ISA水平严重下降或丧失，产生较支链淀粉高度分支化的PG。这说明它们都参与了淀粉合成，但异淀粉酶基因在决定支链淀粉分支结构时起主要作用，pul基因则通过弥补异淀粉酶基因功能而影响淀粉的分支结构。

水稻淀粉脱分支酶（DBE）分为两类，即异淀粉酶（ISA）、普鲁蓝酶或称极限糊精酶（Pullulanase，PUL；Limitdextrinase，R酶）。目前，已知淀粉脱分支酶的同工型基因主要有3个异淀粉酶基因（ISA1、ISA2、ISA3）、1个糊精酶基因或称R酶基因（pul）。

异淀粉酶（ISA）编码基因突变后，支链淀粉的积累则达不到正常水平，因此认为，此酶参与淀粉的生物合成。Genschel等（2002年）在小麦的叶片和发育种子中都检测到ISA，主要以可溶性形式存在于发育的胚乳中，很少一部分与淀粉粒结合，这表明ISA可能参与叶片和籽粒中淀粉合成。Kubo等（1999年）报道，玉米突变体Sug1（Sugary1）胚乳中淀粉生物合成量显著减少。在水稻、玉米Sug1突变体胚乳中dbe的缺失，会造成PUL或ISA水平严重下降或丧失，产生较支链淀粉高度分支化的PG。高大山羊草的异淀粉酶基因转到水稻Sugary突变体中后，直链淀粉的合成与野生型无明显差异，这些都说明ISA直接参与了支链淀粉的合成。另外，Nakamura等（2010年）发现，水稻中有sug1基因编码突变的ISA，此突变的ISA产生畸形淀粉粒。Kubo等（2005年）的研究不但支持了Nakamura的报道，而且发现水稻sug1突变影响ISA的同时，也影响PUL。由此说明，DBE基因对淀粉的生物合成存在多重效应。

利用Tigr水稻基因组数据库搜索异淀粉酶基因，共发现4个Locus注释为ISA基因的，分别位于第3（LOC_O03g48170）、第5（LOC_Os05g32710，LOC_Os05g08110）和第8（LOC_Os08g40930）染色体上。其中，LOC_Os08g40930与ISA1为同一个基因，LOC_Os05832710与ISA2为同一基因，而ISA3基因通过基因组比对后，发现与LOC_Os09g29404为同一个基因，注释基因为葡聚糖操纵子基因glgx。

水稻异淀粉酶（ISA）有ISA1、ISA2和ISA3 3个同工型，其中ISA1主要在胚乳灌浆早期表达，活性表达的最适温度为30℃；ISA2在叶片和胚乳中均有表达，ISA2基因与玉米ISA2基因有78.5%的同源性，而与马铃薯、拟南芥中ISA2的同源性分别只有51.5%和30.8%；ISA3在胚乳中表达量较低，主要在叶片中表达，ISA3基因与玉米、马铃薯及拟南芥ISA3基因的同源性分别为86.9%、73.4%和72.9%。对水稻 ISA1突变体sug1研究发现，ISA的表达与支链淀粉聚合度小于12的链长比例有关。将正常的水稻 ISA1基因导入突变体sugary1中，突变体表型转换为野生ISA2缺少酶催化位点。生物化学研究揭示，ISA2可能与ISA1形成异源复合体后起催化作用。Utsumi等（2011年）研究发现，在水稻胚乳中，只有ISA1同源复合体在淀粉合成过程中具有功能，异源复合体不具有功能，但是在叶片中ISA1-ISA2异源复合体也参与淀粉合成，且比ISA1同源复合体更适应高温（40℃）条件下淀粉的合成。朱立楠等（2015年）对5个直链淀粉和支链淀粉含量不同的粳稻品种，在胚乳发育过程中ISA基因表达量和活性的研究发现，ISA1在整个胚乳发育过程中的表达量明显高于ISA2，且ISA1的基因表达量、酶活性与支链淀粉含量正相关。这些研究表明，ISA对支链淀粉的正确合成具有重要的作用，包括剪切支链淀粉的过分支或者移除不当分支，保证支链淀粉簇状结构的形成。

Nakamura等（1996年）首先分离到水稻pul基因的cDNA克隆，随后以该cDNA为探针筛选到pul基因组克隆。与大麦（Hordeum vulgare）等pul基因进行比较发现，不同作物间pul基因的大部分外显子都是高度保守的（Francisco et al.，1998）。1999年他们又获得了水稻异淀粉酶基因的cDNA克隆，该cDNA克隆与玉米Sugary-1异淀粉酶基因的序列同源性很高（Kubo et al.，1999）。水稻糖质（sugary-1）突变体的胚乳有植物糖原域和淀粉域。糖原域内α-1，4链的A链增加而B链降低，该域的淀粉分支结构消失。进一步分析发现，该突变体中ISA和PUL的活性都显著降低，不过前者在整个胚乳中几乎完全缺乏活性，而后者只在糖原域中活性降低。这说明它们都参与了淀粉合成，但异淀粉酶基因在决定支链淀粉分支结构时起主要作用，pul基因则通过弥补异淀粉酶基因功能而影响淀粉的分支结构。同时还发现水稻Sugary-1基因，即为编码水稻异淀粉酶的基因（Nakamura et al.，1996；Kubo et al.，1999）。现已知Sugary-1基因位于第8染色体上，因此，sugary-1突变体中的损伤基因不可能是位于第4染色体上的ISA基因，但是pul活性也降低，这就暗示Sugary-1基因产物可能通过某种反式作用调控着pul基因的表达。这种反式调控机理还需进一步探明。

在水稻中，pul基因位于第4染色体上，在整个灌浆过程中都有较高水平的表达，同时在灌浆的中后期达到峰值。Fujita等（2009年）研究发现水稻pul缺失突变体聚合度为13～29的链降低，聚合度小于12的短链增加，但增加幅度要低于sug1突变体；但pul/sug1双突变体聚合度小于7的短链增幅，则高于sug1突变体。玉米PUL 突变体pul-204的胚乳结构和组成相较于野生型并没有明显不同，但sul/pul-204双突变体胚乳中大量积累植物糖原。这些研究结果表明，在胚乳淀粉合成过程中，PUL可能对ISA起到补偿作用。最近的研究表明，PUL与稻米淀粉的理化特性具有显著的相关性。Tian等（2009年）研究发现PUL+885的SNPs对直链淀粉的含量具有微效影响。Yan等（2011年）分析了118份糯稻中17个淀粉合成相关基因发现，10个淀粉合成基因涉及控制RVA 谱特性，其中PUL与 PKV、HPV、CPV、BDV和PT显著相关。Kharabian-Masouleh等（2012年）对233份水稻淀粉合成相关基因进行测序，并将获得的SNPs与淀粉理化特性进行关联分析发现，PUL的两个SNP与PT、GT和CHK有相关性。Yang等（2014年）研究发现，在以SSSIIa的GC/TTSNP为协变量条件下，PUL为HD的主效位点。这些研究结果表明，PUL在水稻淀粉合成过程中具有重要的作用。

Fujita等（2003年）发现，含有单个sug1基因的水稻中几乎不能合成支链淀粉。sug1突变可引起PUL和ISA的缺失，对突变体sug1中的PUL活性和电泳特性分析结果表明，PUL和ISA属转录后调控。玉米中的PUL参与胚乳淀粉的降解。不同物种之间的同一同种型编码基因序列间表现60%～80%的一致性，同一物种2个同种型序列间表现却明显不一致。因此，ISA和PUL在多糖链的合成中起不同的作用，功能并不重叠。PUL基因在ISA 缺失型中表达，可产生野生型中未发现的植物糖原，从而表明ISA和PUL之间有部分互补作用。Jason等（2003年）研究了由于转座子插入突变而无正常功能的玉米PUL编码基因pul，结果表明，突变纯合体PUL不能转运和贮藏淀粉，发育中的胚乳积累了不存在于野生型中的PG。上述不同种类的突变体不仅支链淀粉合成减少，而且PG呈明显积累趋势，这些都说明PUL不仅直接参与了支链淀粉的合成，而且PUL和ISA之间有部分互补作用。

SDBE的活性受淀粉同工酶的催化，其活性的降低或缺失使得前支链淀粉的聚集。SDBE中的RE主要以限制性糊精、支链淀粉为底物，而Isoamylase在β限制糊精为底物时活性很高，而对支链淀粉则显示出很低或是没有活性。在上述几种酶的共同作用下，才使淀粉具备了特定的结构。可溶性淀粉合成酶在颗粒表面使短链延伸，最初这些链还太短，不能被SBE作为底物（一般SBE与双螺旋结构的链作用），所以是未分支的。当它们达到一定长度时，在SBE和SSS的共同作用下形成分支。SDBE可去除这些未组装起来的暴露在葡聚糖外面的分支，但是却不能打断那些紧密结合形成双螺旋区的分支。所以SDBE的作用，使得在双螺旋区的上部形成一短链区，这些短链又可被SSS在下轮中重新延伸。目前，已从不同的作物中分离并克隆出多种酶的基因或是同一酶的不同基因片段。通过对这些基因的分析发现。AGPase基因有9个内含子、10个外显子。水稻与玉米、大麦的GBSS基因序列都含有13个内含子和14个外显子，外显子大小极其相近，它们之间的核苷酸存在高度的同源性，而内含子大小差异大，且序列同源性也较低。对SBEl基因（Sbel）结构分析发现，它含有14个外显子、13个内含子，侧翼区域含有许多启动子的共有序列，而且还发现在启动子区出现许多重复序列和G-box基元。Sbe1内含子的GC富集区能形成稳定的二级结构，从而抑制了剪切。大多数基因都编码转运多肤，都携带有许多蛋白激酶磷酸化位点和一些酞基化位点。这些酶基因普遍具有内含子数目多，第1、2内含子大，都编码转运多肽且表达时期基本相同。

淀粉脱分支酶基因在水稻淀粉合成中的作用

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