水稻淀粉脱分支酶分为两类，即异淀粉酶、普鲁蓝酶或称极限糊精酶。目前，已知淀粉脱分支酶的同工型基因主要有3个异淀粉酶基因、1个糊精酶基因或称R酶基因。在水稻、玉米Sug1突变体胚乳中dbe的缺失，会造成PUL或ISA水平严重下降或丧失，产生较支链淀粉高度分支化的PG。这说明它们都参与了淀粉合成，但异淀粉酶基因在决定支链淀粉分支结构时起主要作用，pul基因则通过弥补异淀粉酶基因功能而影响淀粉的分支结构。......
2023-06-20
淀粉分支酶基因及其在种子发育中的调控
【摘要】：根据淀粉分支酶的催化特性，淀粉分支酶主要有两类基因编码，目前水稻分支酶基因已知有3个，即SBEI、SBEIIa和SBEIIb。该SBEII与玉米、水稻和豌豆SBEII有极高的同源性，SBE2基因在种子发育早期表达，成熟期间则下降。水稻分支酶基因都高度同源。Nakamura等也从发育水稻种子中纯化到2个淀粉分支酶同工酶——SQEI和SQEII，分子量约80kD和85kD。这个结果表明，fro-2基因可能在种子发育特异阶段调节一些参与淀粉合成的基因表达。
根据淀粉分支酶（SBE）的催化特性，淀粉分支酶主要有两类基因编码，目前水稻分支酶基因已知有3个，即SBEI、SBEIIa（SBE4）和SBEIIb（SBE3）（表3-5）。
表3-5 植物SBE同形体的归类
Burton等（1995年）从豌豆（Pisum Sativum）胚中首先分离了SBEA和SBEB编码基因的cDNA，并据此推测其氨基酸序列，与后来从玉米、水稻和马铃薯中分离得到的分支酶SBEI和SBEII的氨基酸序列有高度同源性。比较它们的序列时发现，SBE成熟蛋白质要么是N末端存在可变基团，要么是C端存在数量不等的多肽延伸。由于编码这些酶的基因既不是源于同源位点（Locus）的等位基因，也不是同工酶编码基因，它们的功能是否相同仍属未知，所以，国际上的通用名称是同种型。根据Burton等的研究，SBE按其是否有N末端多肽延伸和C端多肽延伸区，分为同种型A和B，有N末端多肽延伸的SBE称为SBE B，有C端多肽延伸的SBE称为SBE A。现在逐渐趋向于用同种型SBEII和SBEI代替SBE A和SBE B，但在玉米和拟南芥的淀粉合成研究中发现了例外的情况。
Fisher等（1996年）从玉米（Zea Mays）胚乳中克隆了3个明显不同SBE的同种型——SBEI、SBEIIa和SBEIIb，比较它们的序列时发现，SBEIIa和SBEIIb的主要区别是SBEIIb的N端有另外49个氨基酸延伸。Gao等（1996年）克隆了2个拟南芥的SBE（SBE2.1和SBE2.2）编码基因cDNA，序列分析表明，二者的3’端和5’端有区别，但它们编码的蛋白质呈90%一致性。在Fisher等（1996年）工作的基础上，Gao等（1996年）证实胚乳SBEIIa和SBEIIb是由不同基因编码的2个独立蛋白质。
Nair等（1997年）从小麦（Triticum Aestivum cv.Fielder）胚乳中克隆了SBEII编码基因的cDNA，开放可读框编码823个氨基酸组成的SBEII蛋白质，其中包含54个氨基酸残基组成的转运多肽。该SBEII与玉米、水稻和豌豆SBEII有极高的同源性，SBE2基因在种子发育早期表达，成熟期间则下降。Morell等（1997年）从发育的六倍体小麦胚中分离并部分纯化和特征化了3个SBE的同种型。免疫活性杂交显示，分子量为88kD的SBEIad和分子量为87kD的SBEIb与玉米的SBEI相似，分子量为88kD的SBEII相似于玉米SBEII；用不含正常SBE的四倍体小麦纯系研究结果表明，SBEIb基因位于小麦的7B染色体上，SBEIad是多聚体，编码基因分别来自染色体7A和7D。Rahman等（1998年）克隆了小麦胚SBEIIa编码基因的gDNA，该基因包含22个外显子，位于小麦第2染色体的长臂上。
Yamanouchi和Nakamura（1992年）分离了水稻Q-酶（SBE）。在此基础上，Mizuno等（1992年）从未成熟水稻种子中分离到4种形式的淀粉分支酶，分别称为SBE1、SBE2（SBE2a和SBE2b的混合物）、SBE3（SBEIIb）和SBE4（SBEIIa）。SBEl、SBE2a和SBE2b为主要形式，它们的分子大小、N-末端氨基酸序列以及与抗玉米分支酶（SBEI）的抗体免疫反应等都是相同的，仅SBE2a的分子量较SBE1和SBE2b大3Da，表明它们是相同的淀粉分支酶类型，故统称为SBEI。用玉米SBEI cDNA作探针分离到水稻的SBEI cDNA克隆。研究表明，水稻SBEI基因最初合成820个残基的前体蛋白，包括在氨基末端的64或66残基的转运多肽，成熟SBEI含有756（或754）个氨基酸，分子量为86.7kD（或86.5kD）。Northern杂交显示，SBEI在开花后7～15 d大量积累，以后迅速下降，而蛋白质的积累要明显延迟，而SBE3蛋白质的积累比SBEI要早一些。这种表达方式与Waxy一致，SBEI和Wx基因表达在种子发育中期达到最高。对SBEI的基因结构分析发现，SBEI由13个内含子和14个外显子组成，侧翼区域含有许多启动子的共有序列，并且在启动子区出现许多重复序列和G-box基元，这些表明反式作用因子参与了SBEI基因表达的调控（Kawasaki et al.，1993）。SBE4和 SBE3分别位于第4和第2条染色体上，都含有21个内含子和22个外显子，且两个基因后19个外显子的长度相同。水稻分支酶基因都高度同源。Mizuno等（2001年）研究发现，成熟的SBE4与SBE3、SBEI都存在较高同源性，分别为80%和47%。SBE3和SBEI相比，N末端具有70个氨基酸残基的肽段，而C末端则少了50个氨基酸残基的肽段；SBE4与SBEI相比，N末端多90个氨基酸残基，而C末端少59个氨基酸序列。
Nakamura等（1992年）也从发育水稻种子中纯化到2个淀粉分支酶同工酶——SQEI和SQEII，分子量约80kD和85kD。从蛋白酶解图和Western杂交结果可看出，SQEI和SQEII是由不同基因编码的产物。Nakamura等（1992年）同时也报道了SQEII的cDNA 序列，1994年将SQEI定位于第6染色体，在标记R1167和G342之间，并证明是单拷贝的（Nakamura et al.，1994）。Kawasaki等（1993年）发现，水稻隐性floury-2（fro-2）位点位于第4染色体上，导致开花后10d的未成熟发育种子编码SBE的基因表达大为下降。SBE1作图表明，该fro-2基因位于第6染色体上，表明野生型Floury-2是通过反式作用调控SBE1基因表达。但在fro-2种子中同时也发现编码其他酶，如SBE3和GBSS的基因表达也下降，虽然fro-2突变体未成熟种子的SBE1基因表达水平很低，但在叶片中突变体和野生型SBE1基因得到同等表达。这个结果表明，fro-2基因可能在种子发育特异阶段调节一些参与淀粉合成的基因表达。
为了研究 SBE1和 SBE3基因在功能和表达调控上的差异，研究人员分别筛选了相应的突变体。Mizuno等（1993年）对ae突变体的研究表明，突变体缺乏87kD SBE3 同工型活性，而GBSS和SBEI的同工型则没有改变。分离出SBE3 cDNA，推断氨基酸序列，表明该蛋白最初的氨基酸序列是825AA 的前体，包括N-末端65残基的转运多肽。SBE3和SBE1有许多序列相同，特别是蛋白质分子中心区域。但SBE3拥有N-末端70个AA 残基序列，并在C-末端与SBE1相比约缺少50AA序列，这种两末端的结构差异可解释SBE1和SBE3在淀粉合成中的功能差异。SBE3基因和SBE1基因一样，只在发育种子中表达，SBE3 mRNA在开花5～15 d种子中大量积累，这种表达方式也与SBE1和GBSS基因相同。Harrington等（1997年）通过水稻RFLP分子标记图谱，将 SBE3定位于第2染色体上。两侧是CO718和RG157标记，检测到多拷贝杂交模式，表明在这个位点可能存在串联重复基因。Satoh等（2003年）采用N-甲基-N-亚硝脲（N-methyl-N-nitrosourea，MNU）处理可育的雌配子，获得SBEI 缺失突变体。遗传分析表明，该突变体受一对隐性基因控制，被命名为sbe1。有趣的是，该突变体表现出正常的胚乳表型，并且淀粉含量与野生型相同，但支链淀粉的结构明显发生改变。当长链聚合度为37和短链聚合度介于12～21时，突变体中的支链淀粉含量显著下降；当短链聚合度为10时，含量显著增加。由此表明，SBEI可以特异性地合成B1和B2～3链。
淀粉分支酶基因SBE1和SBE3，还与淀粉合成酶基因Wx存在联合效应。严长杰等（2006年）以53个典型的籼粳品种和近年育成的高产水稻品种为材料，分析了供试品种的理化品质和 RVA 谱特征，并利用根据籼粳基因组序列差异设计的Wx、SBE1、SBE3 基因的分子标记，检测了53个水稻品种的基因型，并分析了3个基因位点的遗传学效应。结果表明，3个分子标记均能很好地区分3个位点上等位基因的籼粳来源。根据3个位点的基因型，可将53个品种分为6 种类型。单个基因遗传效应分析表明，在不同基因型品种间淀粉的理化特性（AC、GC、RVA）存在显著或极显著差异，3个基因的联合效应在不同基因型组合间也存在显著差异，表明3 个基因在高产品种培育过程中得到了广泛的交流和重组，而且3个基因位点上的不同等位基因（籼粳）对稻米淀粉合成具有不同的遗传效应。其中，Wx基因的影响是最主要的，SBE1、SBE3 基因次之。在以上研究结果的基础上，本研究增加了供试品种数目，共检测了183个水稻品种的基因型，分析了3个基因对稻米理化品质和RVA 谱特征的效应。结果表明：3个分子标记均能很好地区分3个位点上等位基因的籼粳来源，根据3个位点的基因型，可将183个品种分为8种类型。单个基因遗传效应分析表明，不同基因型品种间淀粉的理化特性（AC、GC、RVA）存在显著或极显著差异，3个基因的联合效应在不同基因型组合间也存在显著差异。Wx基因对大多数品质性状效应显著。SBE1和SBE3基因在不同的Wx等位基因背景下，对稻米的品质的理化特征的效应不同。3个基因间存在互作效应，Wx与SBE3的互作效应较大。
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