淀粉合成酶基因对水稻淀粉特征的影响

水稻中SS基因家族共有5个亚族10个基因，包括2个GBSS基因、1个SSI基因、3个SSII基因、2个SSIII基因和2个SSIV基因。颗粒结合型淀粉合成酶（GBSS）催化合成直链淀粉，而Wx基因通过编码 GBSS来控制直链淀粉含量，后者是决定稻米蒸煮食味品质的主要因素（Aryes et al.，1997；包劲松等，1999年；吕英海和李建粤，2005年；孙业盈等，2005年）。水稻Wx基因首先由Okagaki和Wessler（1988年）克隆，随后Wang等（1990年）报道了Wx基因的核苷酸序列。Hirano和Sano（1991年）利用玉米Wx+DNA克隆了水稻Wx+基因，并制备了水稻Wx+蛋白的抗血清，研究发现Wx+基因由许多外显子和内含子组成。推测的氨基酸序列表明Wx+多肽由一个含77个氨基酸残基的转运多肽和一个含532个氨基酸残基的成熟蛋白组成。Wx+基因的表达调控是组织和发育时期专一性的，Northern杂交显示Wx+基因在授粉后13～18 d表达量最高，此后则几乎不再表达。

在不同直链淀粉水稻品种中，Wx基因类型不同。Wang等（1995年）研究发现，在直链淀粉含量高的水稻品种（20%，第一类型）的未成熟种子中，Wx基因只有一种分子量为2.3 kb的成熟转录物；在直链淀粉含量中等或偏低的水稻品种（6%～16%，第二类型）的未成熟种子中，Wx基因除了成熟转录物外，还有一个含有第1内含子的前体mRNA（分子量为3.3 kb）。由于糯稻品种无直链淀粉，未观察到Wx基因的mRNA 转录本。Cai等（1998年）用反转录PCR和DNA测序分析发现，不同水稻品种中Wx基因第1内含子存在多种剪接位点。这些不正常的剪接现象说明剪接过程发生了故障，因而影响剪接效率。Wx基因第1内含子的5’供体旁邻顺序的分析表明，第一类品种第 1外显子和第1内含子连接处是G（CAAGgtat），第二类则是A（CAAgttat）。第一内含子被剪接后，在第二类水稻的第1外显子和第2外显子连接处产生了一个新的起始密码子AUG，它与编码区中正常起始密码子的读框不一致。该单核苷多态性可以解释89个非糯品种的79.7%表观直链淀粉含量变异（Arys et al.，1997）。这些研究说明，不同水稻品种中胚乳直链淀粉的含量，受Wx基因转录后加工，尤其是第1内含子从前体mRNA切除效率的调控。

已有研究证明，水稻Wx基因的转录能力与Wx蛋白含量、直链淀粉含量关系密切。Wang等（1995年）发现Wx基因有2种转录本，片段大小分别为2.3 kb和3.3 kb。据此将Wx基因转录本分为3种类型：高直链淀粉含量的籼稻品种产生成熟的2.3 kb mRNA；低等直链淀粉含量的籼、粳稻品种除产生2.3 kb mRNA外，还产生第1内含子未被切除的3.3 kb前体mRNA；糯稻只产生痕量3.3 kb的前体mRNA。葛鸿飞等（2000年）研究发现，糯稻也具有从转录本中剪接第1内含子的正常能力，缺乏直链淀粉是由于第1内含子中某些碱基发生突变的结果。这与Isshiki等（2010年）报道一致，即Wx基因第1内含子5’端保守序列中的GT突变成TT，是造成中、低等直链淀粉含量品种的Wx基因第1内含子剪接效率低的原因。为了深入探讨Wx基因的表达调控机理，人们对降低水稻直链淀粉含量的dull突变基因如何抑制基因的表达进行了研究。目前已发现9种不同的水稻du基因，已经定位的都不在第6染色体上（Wx基因所在的染色体），其中du-1和du-2基因使Wxb转录剪接效率大大降低，而对Wxa前体 mRNA的剪接无太大影响，这说明du-1和du-2是控制Wxb转录剪接效率相关基因的突变基因（Isshiki et al.，2010）。据此可以分离、克隆不同的基因及其核调控蛋白，再依据反式作用原理剖析Wx基因的时间和组织特异性表达机理，从而为在分子水平上改良稻米品质提供理论依据。

Hirano 等（1995年）研究了水稻Wx基因在花粉与胚乳中的表达差异，发现Wx基因的剂量效应依赖于Wxa和Wxb的共同作用，Wxa的表达量大约为Wxb的10倍。在低温条件下，Wxb表达丰度、GBSS蛋白含量和GBSS活性均增加Wxa表达，几乎不受影响。程式军等（2002年）研究认为，水稻bZIP家族的转录因子REB能结合水稻Wx基因启动子GCN4基因序列，对Wx基因的表达起着调控作用。Dian等（2003年）研究发现，GBSSII与其他植株的GBSS具有62%～85%的同源性，与GBSSI具有73.3%的同源性，外显子及内含子结构相似，主要在叶片中表达，合成叶片中的直链淀粉。受昼夜周期的影响，低的氮素水平、蔗糖含量能促进GBSSII的转录。

稻米RVA谱是指稻米淀粉与一定量的水混合后，米浆在不同温度下的黏度变化曲线，可以比较灵敏地反映不同品种间淀粉的品质差异。为此，对RVA谱各特征值的研究已受到广泛重视。Bao等（2000年）以窄叶青8号与京引17的DH群体进行QTL定位发现，RVA谱几种主要特征值的表现均与Wx基因有关，因而认为稻米的RVA谱主要受Wx基因控制。吴洪恺（2006年）利用桂朝2号与苏御糯杂交和回交后代选取的遗传材料研究表明，颗粒结合淀粉合成酶基因Wx对稻米淀粉RVA谱主要特征值确实有重要影响。表现在该基因座的基因型为WxaWxa时，与淀粉合成相关的其他基因座单一基因型改变（被苏御糯的相应基因替换），一般不会显著改变RVA谱的主要特征。当Wxa被源于苏御糯的隐性基因Wx置换以后，淀粉合成其他基因发生改变后的效应便会明显表现出来。

Wx基因对稻米淀粉品质起着极为重要的作用，进一步研究Wx基因座可能存在的等位性变异，不同复等位基因对稻米淀粉品质的影响，有着重要意义。王宗阳等（1995年）研究发现，Wx基因第一内含子+1碱基G/T变异，可影响转录后RNA的剪切效率，从而影响GBSS的合成数量，进而影响稻米胚乳直链淀粉的含量（Cai et al.，1998）。Bligh等发现，Wx基因启动子区存在的微卫星序列（CT）n重复数与Wx基因的表达存在明显相关关系（Bligh et al.，1995）。但是，Wx基因究竟存在多少个复等位基因变异，这些变异对稻米品质有何影响，尚待进一步的研究。

可溶性淀粉合成酶（SSS）与 GBSS、淀粉分支酶（SBE）相互作用，分别合成直链淀粉和支链淀粉，并影响淀粉的链长和分支频率。Baba和Tanaka（1993年）利用阴阳离子交换层析法，从水稻未成熟种子的可溶性提取物中分离出3种分子量分别为55 kDa、57 kDa和57 kDa的SSS，每一种SSS又进一步用亲和层析法纯化。用由 GBSS 制备出来的抗血清与上述3种蛋白进行Western杂交，结果表明，3种蛋白的氨基酸序列同源性很高（除55 kDa蛋白在N末端缺少8个氨基酸残基外）。由此推断，这3种蛋白是同一基因的产物。用合成的寡核苷酸作为探针从未成熟种子中分离出cDNA克隆，序列分析初步推测，编码氨基酸序列中含有作为淀粉和糖原合成酶的ADPG结合位点的lys-X-gly-gly保守序列，由此可以认定这种蛋白就是水稻未成熟种子中的SSS。该酶的前体含有626个氨基酸残基，包括N末端的由113个氨基酸残基组成的转运多肽。成熟SSS与GBSS和Escherichia coli糖原合成酶的序列相似性很低，但3种酶中的许多区域包括底物结合位点是高度保守的。斑点杂交分析表明，编码SSS的基因为单拷贝，并在叶片和未成熟种子中表达。Northern杂交结果显示，在开花后5～15 d SSS mRNA 含量最丰富，mRNA 的积累方式与 SBE 相同。这些结果说明 SSS 和 GBSS 在淀粉合成中起着不同的作用。

SSS是由多基因家族编码。根据氨基酸同源性，可将SSS分成SSSI、SSSII，SSSIII和SSSIV等4个亚家族，每一亚家族又可分为不同的同工型。水稻中共有8个SSS同工型，包括1个SSSI，3个SSSII（SSSII-1、SSSII-2和SSSII-3），2个SSSIII（SSSIII-1和SSS III-2）和2个SSSIV（SSSIV-1和SSSIV-2）（Fujita et al.，2007）。这些酶共同催化转移可溶性的前体ADP-Glc至α-1，4糖苷键还原末端，连接葡聚糖的前体，以合成不溶性的葡聚糖多聚物支链淀粉和支链淀粉（Tetlowet al.，2004）。根据SSS基因的表达模式，可将上述的酶分为早期表达、后期表达、稳定表达3种类型。SSSII-2和SSSIII-1在种子胚乳的早期表达，SSSII-3和SSSIII-2表达量在稻米的灌浆期达到最高，表现为后期表达（Hirose et al.，2004）。因此，可推测SSSII-3和SSSIII-2这两个基因在稻米胚乳中，对淀粉的合成起着重要作用。

SSSI是SSS 4个亚家族中唯一没有同工型的酶。Tanaka等（1995年）成功地从水稻中分离了SSSI基因，该基因位于第6染色体上，与Wx基因距离只有5cM，有14个内含子和15个外显子，前体蛋白含有33个氨基酸转运肽。SSSI基因在水稻中组成性表达，在胚乳中表达丰度最高，主要在灌浆期早期表达，开花后5～15 d mRNA丰度最高。随后，Tanaka和Baba（1993年）以该 cDNA片段为探针获得了SSSI基因组克隆。通过比较 SSSI cDNA与其基因组克隆时发现，前者转录物（2.7 kb）比后者外显子总长（2.5 kb）大200bp，这可能是因为SSSI基因的5’端非编码区还有1个外显子。二者在转运肽内都含有保守序列lys-ser-glygly，该序列是淀粉合成酶结合ADP-葡萄糖的位点。利用阴离子交换层析分离技术从植物中提取的可溶性淀粉合成酶活性存在两个峰，峰I的SSS能在较高柠檬酸盐存在时催化无引物的寡葡聚糖，合成较短的支链淀粉分支。峰II的SSS在有引物时才具有催化活性，主要催化支链淀粉中等长度支链的形成（Tanaka et al.，1971）。研究证实峰I主要是SSSI，峰II主要是SSSIII，SSSI的活性高于SSSIII，占可溶性淀粉合成酶总活性的70%（Nakamura et al.，2005）。

在水稻中克隆到3个SSSII编码基因，根据其在GenBank中登录顺序分别被命名为SSSII-1、SSSII-2和SSSII-3，分别位于水稻的第10、2、6号染色体上。SSSII-3又称为SSSIIa或ALK，在水稻胚乳中特异表达；SSSII-2又称为SSSIIb，主要在叶片中表达，推测可能与叶片临时性淀粉的合成相关；SSSII-1又称为SSSIIc，主要在胚乳中低丰度表达。3个水稻SSSII同工型相互之间的氨基酸同源性为51%～64%，其中SSSIIa与SSSIIb同源性较高，而它们与SSSII-1的同源性较差，3个基因与玉米、豌豆、小麦、拟南芥和马铃薯的SSSII之间有53%～73%的同源性（Hirose et al.，2004）。Umemoto等（2002年）研究证明，SSSIIa基因的等位差异是导致粳稻日本晴和籼稻“Kasalath”胚乳支链淀粉链长分布差异的最主要原因。利用粳稻日本晴和籼稻“Kasalhat”来源的杂交后代群体，将控制糊化温度（GT）差异的Alk基因、gel（t）基因、控制支链淀粉长分布的acl（t）基因等都定位于与SSSIIa相同的位点。同时还发现SSSIIa等位基因的变异，导致了水稻品种间支链结构的改变；SSSIIa主要负责延伸较短支链（A+B1），将较短支链（DP＜12）延长合成支链中等长度的分支（12＜DP＜24）。高振宇等（2003年）利用图位克隆的方法，分离克隆了水稻GT主效基因（ALK），序列分析表明其编码SSSIIa，SSSIIa在籼稻中的活性高于粳稻。籼稻和粳稻中，在SSSIIa位点发现了4个可变氨基酸。粳稻中Asp-88和Ser-604分别被籼稻中Glu-88和Gly-604所代替，粳稻中Met-737和Phe-781分别被籼稻中Vat-737和Leu-781所代替。SSSIIa主要将短链A和B1延伸合成支链淀粉中等长度的长链B，导致了SSSIIa酶活性的高低，使支链淀粉的结构成为L-型或S-型（Nakamura et al.，2002）。SSSIIa基因在水稻淀粉合成中起主要作用，编码区由8个外显子、7个内含子组成，该基因的活性的差异影响着糊化温度，如Jiang等（2004年）发现基因SSSIIa，与Umemoto等（2002年）报道的SSSIIa，高振宇等（2003年）报道的糊化温度 ALK基因是同一基因。该基因在不同水稻品种间有一定的序列差异，特别是基因编码区内存在碱基替换现象，导致了氨基酸序列的改变，可能造成了SSSII酶活性的变化，进而影响支链淀粉的中等长度分支链的合成，使淀粉晶体层结构改变，最终表现为糊化温度（Gelatinization Temperature，GT）的改变，这也是籼、粳稻亚种间支链淀粉结构不同的主要原因。水稻中缺失SSSIIa后，对稻米品质有着较明显影响，糊化温度明显降低。在豌豆胚中，SSSIIa的缺失导致支链淀粉中间长度的链减少，短链增加，表明SSSII在中间长度链的合成中有专一作用，而其他同工型酶不能互补这种缺失作用（Craig et al.，1998）。转基因和突变体的研究都表明，SSSII主要负责延伸较短支链，合成支链淀粉中等长度的分支，其活性的缺失会导致淀粉积累减少或支链淀粉结构或淀粉粒结构的改变，其功能无法被其他SSS同工酶所代替（Lloyd et al.，1999；Denyer et al.，1992）。

水稻和玉米发育的胚乳中，SSSIII活性是继SSSI后的第二大类淀粉合成酶。植物SSSIII由15个内含子和16个外显子组成，后13个外显子的长度在不同物种中都相同，第3个外显子长度变化很大，是SSSIII基因的高度可变区。SSSIII基因突变可引起玉米暗胚乳表型，又称为dull突变体，因此，SSSIII基因又可被称为Dull（Dul）基因，Dull在玉米胚乳中特异表达（Gao et al.，1998）。拟南芥的SSSIII突变可改变叶中的淀粉结构，使支链中的长链增加，并带来更高的磷含量，且总SSS酶活增强，由此推测SSSIII在拟南芥的淀粉合成中发挥负调控的作用（Zhang等，2008年）。Abel等（1996年）利用反义RNA技术转化马铃薯，使SSSIII减少，引起了淀粉结构的改变，淀粉粒形态发生巨大变化，共价结合的磷酸基增多。Fujita等（2007年）通过水稻突变体研究SSSIIIa缺失后，稻米品质变化明显。直链淀粉含量有一定的增加，发现SSSIIIa缺失的突变体中参与支链淀粉链长延伸的DP≥30的B2和B4链和支链淀粉的分子量与野生型相比较，分别下降了60%和70%。在水稻SSSⅢa突变体中，SSSIIIa酶活性的缺失导致了支链淀粉长链DP＞30链缺失，短链6＜DP＜9，16＜DP＜19减少，10＜DP＜15，20＜DP＜25链增加，这意味着SSSIIIa负责支链淀粉的长链合成。另一方面，也提高了SSSI和GBSSI的转录水平。在马铃薯中，当SSSII或SSSIII单一基因反义抑制植株与SSSII和SSSIII同时被抑制的转基因植株时，可发现一种SSS对支链淀粉合成的影响明显依赖于另一种SSS的活性（Lloyd et al.，1999）。这种协同效应说明植物体内特定一种SSS同工酶对淀粉合成的贡献，除与它自身的特性有关，可能还与其底物的结构有关，即与其同工酶乃至整个淀粉合成网络中其他各类酶（如AGPP、GBSS、SBE、DBE等）的活性有关。

目前为止，人们对谷物中SSSIV同工型对葡聚糖链长度的作用知之甚少。Hirose和Terao（2004年）在水稻中发现SSSIV有两种同工型SSSIVa和SSS Ivb，且它们在水稻生长的整个阶段表达相对稳定。在谷类植物中，还没有SSSIV的突变体可用来研究其功能。前人预测SSSIV蛋白和其他可溶性淀粉合成酶在C-末端（催化结构域和淀粉结合结构域）具有高度相似性，而N-末端的差异性比较大（Zhang et al.，2008）。Roldan等（2010年）发现，拟南芥中SSSIV的缺失并未对淀粉结构及其组成造成影响，但对叶绿体中淀粉颗粒数目和大小的影响很大，表明SSSIV这类酶可能与淀粉颗粒的合成有关，且在控制淀粉颗粒的数目上起着特定作用。因此，对于SSSIV可能使人们对淀粉颗粒的合成建立一个新的认识。另外，抑制SSSIV并不能完全消除叶绿体合成淀粉颗粒。Toyosawa等（2015年）发现，SSSIVa或者SSSIVb基因突变对水稻胚乳中淀粉颗粒特性影响不大，在ss4b/ss3b双突变体中淀粉颗粒的数量和种子中淀粉含量变化不大，但是淀粉颗粒由规则的多边形变成了球形，表明 SSSIV 在淀粉颗粒的形成中具有重要作用。通过对SSSIV突变体的鉴定，将有助于人们研究谷物淀粉合成中SSSIV同工型的功能。