印楝内生真菌代谢产物研究成果

2024-03-27 百科知识版权反馈

【摘要】：近年来对植物内生真菌次生代谢产物的研究表明，植物内生真菌能够参与植物活性成分的合成。通过对印楝内生真菌的分离鉴定及抗菌活性和代谢产物的研究，旨在获得有良好抗菌活性的菌株，以寻找新型抗菌物质，并为新型抗菌物质的开发提供丰富的资源。

印楝内生真菌代谢产物的研究

余　丽　艾　薇

摘　要:植物内生真菌能够参与植物活性成分的合成，是重要的活性次生产物来源。印楝作为国际上公认的最有潜力的杀虫植物，以其应用范围广、杀虫效果显著、生物活性物质含量高和易提取等特点，受到全世界的普遍重视，而成为当今世界上最受重视的杀虫植物。本文通过对印楝内生真菌的分离鉴定及抗菌活性和代谢产物的研究，旨在获得有良好抗菌活性的菌株，以寻找新型抗菌物质，并为新型抗菌物质的开发提供丰富的资源。

关键词:内生真菌　印楝　代谢产物

植物内生真菌是指整个生活史或生活史的某个阶段，侵入植物组织内而不表现明显病症的真菌。它们在植物体内广泛存在，并且具有丰富的多样性。由于植物内生真菌长期生活在植物组织内，与宿主协同进化形成了互惠互利的关系，因此在宿主的生长发育和系统演化过程中起着重要作用，可以促进植物生长，赋予植物抗逆性，帮助植物抑制病害。同时一些植物内生真菌还可以产生同植物宿主相同或相似的活性物质。近年来对植物内生真菌次生代谢产物的研究表明，植物内生真菌能够参与植物活性成分的合成。1993年Stierle等从短叶紫杉分离到可以分泌紫杉醇的内生真菌Taxomyces andreanae，可以通过发酵的方式产生紫杉醇。目前已从植物内生真菌中分离到很多结构新颖的化合物，它们普遍具有抑菌、抑制细胞毒或抑制蛋白激酶等活性。如已开发的长春碱、鬼臼毒素、香豆素等都被证明具有很好的抗菌抗肿瘤活性。

印楝作为国际上公认的最有潜力的杀虫植物，以其应用范围广、杀虫效果显著、生物活性物质含量高和易提取等特点，受到全世界的普遍重视，而成为当今世界上最受重视的杀虫植物。

一、印楝的生物学特性

印楝(AzadirachtaindicaA.Juss)，印楝属楝科(Meliaceae)，原产印度和缅甸。树体高大，枝叶茂密，花白色，甜香，果实黄色，长约2cm，果肉味甜，果核内含1粒种子，3年至5年生为初果期，10年生左右为盛果期，每株产果可达20～50kg，结果期长达200年以上。一般生长在海拔700m左右的热带和亚热带地区，适宜在酸性土壤中生长。印楝在国外分布于印度、巴基斯坦、泰国和缅甸等干旱地区。在20世纪20年代作为干旱地区防治沙漠化树种被引种至非洲等地。印楝在中国无自然分布。1986年由赵善欢教授从非洲多哥首次引入中国，在海南万宁县试种获得成功。1995年中国林科院昆虫所赖永祺研究员从印度引入印楝种子，试种于干热河谷地区元江、元谋两地，到1999年，印楝已开花结果，种子具有正常生活力。引种结果表明，印楝在中国干热河谷地区引种已获成功。很多地州引进印楝试种，至1999年底，在云南省玉溪、楚雄、红河等地种植面积约233.33hm²。

Morgan等于1968年分离得到印楝中最主要的活性成分——印楝素(Azadiraehtin)，现已确定了印楝素的分子结构。另外，科学家已从印楝中分离、鉴定出数十种柠檬类化合物。其有效成分印楝素对昆虫具有强烈的拒食、胃毒、触杀以及抑制生长发育作用。现在普遍认为印楝素主要扰乱昆虫的内分泌系统，影响其促前胸腺激素PTTH的合成与释放，减低其前胸腺对PTTH的感应而造成20－羟基蜕皮酮合成、分泌的不足，致使昆虫变态、发育受阻。关于楝科植物次生化合物结构和活性关系，国外进行了不少研究，但进展不大。Simmonds等发现，对于印楝素，C－1，C－3和C－11的替代跟拒食活性相关;环氧化的存在，对毒效和生长发育抑制作用具有重要意义。李晓东等提出，楝科植物次生化合物对昆虫生物活性的强弱主要取决于其环结构以及一些官能团是否存在。至于其结构中与活性相关的主要基团结构为何，目前尚不清楚。

经过近30年国内外对印楝生物活性和化学成分的系统研究，表明印楝不仅具有昆虫拒食和杀虫活性，还有抑制致病真菌和细菌生长、消炎、抗肿瘤、免疫调节等生理活性，具有较高的生物农药和医药价值，同时对环境无污染，对害虫天敌安全，且害虫不易对它产生抗性，完全符合综合防治的要求。因而它具有广泛的应用前景，是未来许多合成农药的理想替代品。目前，对印楝的研究主要集中在对其提取物的防虫治虫效果试验、繁殖栽培技术、植物农药及医药保健品的研制生产和利用。印楝产品生产(主要是印楝农药)还处于起始阶段。云南省已将印楝列为植物资源重点开发项目之一。

二、印楝内生真菌研究

印楝大多数活性物质都属于类似印楝素的四降三萜类化合物，此外还包括一些二萜、三萜、五降三萜及少量的非萜类化合物。通过对印楝内生真菌的分离鉴定及抗菌活性和代谢产物的研究，旨在获得有良好抗菌活性的菌株，以寻找新型抗菌物质，并为新型抗菌物质的开发提供丰富的资源。

(一)内生真菌的分离纯化和鉴定

取健康印楝植株用自来水冲洗干净、晾干水分后，切取印楝植物茎和果实，采用下述方法进行表面消毒: 0.1% L汞漂洗(10～30s)→无菌水冲洗→75%酒精漂洗(0.5～1 min)→无菌水冲洗数次。上述印楝植物样品经处理完毕，植物茎在无菌状态下切成0.2 cm×0.2 cm长段(片)，果实在无菌状态下切成小块分别置于PDA培养基(马铃薯葡萄糖琼脂培养基+青霉素)内，于(28±1)℃条件下静止培养。培养3～7d后，培养基中可见有菌落形成，挑取植物组织周围的菌落转接入PDA斜面中，经纯化后即得内生真菌。采用真菌插片培养方法，对分离获得的内生真菌进行显微形态特征的观察、分类鉴定。活性较好的菌株主要分布在曲霉属和交链孢属，显示较强的广谱抗菌作用。

(二)活性菌株筛选

将内生真菌菌株分别接入含7mL PDB培养基(马铃薯葡萄糖培养基)的三角瓶中，置于(28±2)℃摇床(200 rpm)培养7d，加入等体积95%乙醇超声提取捣碎的菌丝体，过滤，将浸提液浓缩至干，制成发酵样品。并通过抑菌、杀虫活性试验，筛选出具有产活性物质的菌株。

1.抑菌试验

采用滤纸片法(直径10mm)。在无菌条件下分别取供试指示菌［细菌(Bacterium)、皮肤致病真菌(Derma pathogenic fungi)植物致病真菌(Plant pathogenic fungi)］悬液0.2mL，加入相应的固体培养基制成含菌平板，然后分别取蘸有印楝植物内生真菌发酵提取物的无菌滤纸片放入平板内，细菌和皮肤致病真菌置于(37±1)℃，植物致病真菌置于(28±1)℃温箱中，培养48h后，分别测量抑菌圈直径大小，比较抑菌效果，分析代谢产物的生物活性。从中筛选出具有抗菌、杀虫活性物质的活性菌株。

2.杀虫活性研究

选取有针对性的植物害虫，如小菜蛾幼虫、烟粉虱、菜青虫、蝗虫、家蝇、家蚊等，用不同浓度的发酵液进行喷施，在施药前以及施药后2、4、8天调查虫口数量，分析杀虫活性。

(三)代谢产物研究

1.代谢产物的分离提纯(www.chuimin.cn)

将50 L培养基(PDB)分装于500mL三角瓶内，每瓶装140mL，1.25×10 Pa下灭菌30min，冷却后于无菌条件下接种，在28℃摇床(200r/min)培养7d。发酵产物经过滤，分别收集发酵液和菌丝体，发酵液用乙酸乙酯萃取4次，菌丝体用95%乙醇冷浸提取3次，分别合并提取液，浓缩后得粗提物。将此粗提物用硅胶拌样，经200～300目的硅胶柱层析，用不同极性有机物(氯仿－甲醇、石油醚－丙酮、石油醚－乙酸乙酯等按不同比例配制)进行洗脱至纯。

2.活性产物结构鉴定

通过红外光谱、质谱、核磁共振等方法对所得活性物质进行化学结构的分析鉴定，并对分离得到的活性物质进行抑菌、杀虫试验，寻找一些新奇化学结构和有应用价值的化合物。

长久以来，从植物中寻找天然活性物质一直是新药研究的重要内容，但过度采挖终究会造成物种的枯竭。更为严重的是将使一些濒危种受到破坏，使之趋于灭绝，如人参、灵芝、冬虫夏草等。由于植物内生真菌代谢产物丰富，同时近年来不断有从内生真菌中发现新型抗生素的报道，因此从内生真菌中寻找新药或新型化合物是解决上述问题的有效途径之一。同时由于真菌具有分解纤维素、淀粉、蛋白质、脂类等营养物质的强大酶类，对天然培养基有较强的分解利用能力，因而针对真菌自身发酵的研究已成为研究的热点，如灵芝、冬虫夏草、云芝、云南重楼、人参、甘草、大豆异黄酮、茯苓等都有大量的相关研究报道。因此利用植物内生真菌在天然培养基中的发酵培养，不仅为新型抗菌物质的开发提供丰富的资源，在减少对植被的采挖和破坏方面也有重要意义。通过内生真菌发酵获得与天然活性物质药效相同或更好的化合物，将是植物源农药发展的方向。植物源农药所具有的环保、可降解、不会使害虫产生抗药性的优点正符合可持续发展的要求，其对人类无害无毒也满足现在人们对农产品的绿色要求。药用植物内生真菌作为对环境无害农药的新的微生物资源，具有很大的开发潜力和利用价值。

参考文献:

［1］Zhang Y，Proenca R，Maffei M，et al.Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue［J］.Nature，1994(372).

［2］E.D.Morgan，J.H.Butterworth. Isolation of a substance that suppresses feeding in locusts［J］.J Chem Communs，1968(1).

［3］李晓东，陈文奎，胡美英.印楝素、闹羊花素－Ⅲ对斜纹夜蛾的生物活性及作用机理的研究［J］.华南农业大学学报，1995，16(2).

［4］M.S.J.Simmonds.The antifeedant activity of Clerodance diterpenoidster from Teucriu［J］.Phytochemistry，1989，28(4).

［5］李晓东.楝科植物叶抽提物对中华稻蝗的活性研究［J］.华南农业大学学报，1997，18(4).

［6］操海群，岳永德，花日茂，等.植物源农药研究进展［J］.安徽农业大学学报，2000，27(1).

［7］Schmutterer H Ascher KRS.The Neem Tree Azadirachta indica A.Juss.and Other Meliaceous Plants: Sources of Unoque Natural Products for Integrated Pest Management［M］.Medicine，Industry and Other Purposes.Weinheim: VCH，1995.

［8］邵士成，吴少华，等.元江印楝植物内生真菌及其抗菌活性筛选的研究［J］.天然产物研究与开发，2007，19.

［9］吴少华，陈有为，邵士成，等.一株曲霉属印楝植物内生真菌的代谢产物研究［J］.化学研究与应用，2008，20(4).

［10］Wei JC(魏景超).The Identification Handbook of Fungus(真菌鉴定手册)［M］.Shanghai: Shanghai Scientific and Technical Publishers，1979.

［11］H.L.Barnett，B.B.Hunter. Illustration of Deuteromycotina(半知菌属图解)［M］.Beijing: Scientific Press，1977.

［12］G.A.Strobel.Rainforest endophytes and bioactile products［J］.Crit Rev Biotech，2002，22.

［13］Dong Aling，Cui YJ，Guo HZ.Microbiological Transfromation of Ginsenoside Rg1［J］. Chinese Pharmaceutical Sciences，2001，10(3).

［14］何晨，霍蕾，等.甘草的微生物转化［J］.天然产物分离，2005，3(6).

［15］王利国，潘超美，贺红，徐鸿华.抗肿瘤药用植物及其内生菌活性代谢产物研究进展［J］.广州中医药大学学报，2008(02).

［16］李端，郭利伟，郭伟云，李延兰.抗肿瘤药用植物及其内生菌活性代谢产物的研究［J］.安徽农业科学，2009(16).

印楝内生真菌代谢产物研究成果

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