基因芯片技术在生物技术制药实验中的应用

2023-12-07 百科知识版权反馈

【摘要】：实验十一基因芯片技术基因芯片是生物芯片的一种，由分子生物学、微电子学和计算机科学等多种学科相互交融而形成的新技术。基因芯片技术为大规模筛选药物提供了有效的手段，并能够从基因水平揭示药物的作用机理。另外，基因芯片也是诊断同种疾病不同病原体的有效手段。

实验十一　基因芯片技术

基因芯片是生物芯片的一种，由分子生物学、微电子学和计算机科学等多种学科相互交融而形成的新技术。其为基因表达谱的研究、新基因的发现、基因突变的检测、DNA多态性的分析、基因组作图等提供了有效的手段。

1.实验目的

学习基因芯片技术的原理，了解该技术的基本操作步骤。

2.实验原理

基因芯片技术的原理是：基因芯片(genechip)又称DNA芯片或DNA微阵列，以DNA分子杂交技术为基础，将许多已知的、特定的寡核苷酸或基因（cDNA）片段作为探针，有序地、高密度地排列在玻璃、硅片或尼龙膜等载体上，制成DNA微阵列（DNAmicroarray），对待测样品DNA或由RNA通过RT-PCR扩增得到的cDNA进行荧光分子标记，并与芯片上的探针杂交，再经过激光共聚焦荧光扫描系统扫描，检测探针分子杂交信号强度，通过计算机系统对荧光信号综合分析获得样品中大量基因序列及表达的信息。

3.操作步骤

基因芯片技术包括四个主要步骤：芯片制备、样品制备、杂交反应及信号检测和结果分析。

（1）芯片制备

①光导原位合成法：在经处理的载玻片表面铺上一层连接分子，其羟基上加有光敏保护基团，可用光照除去，用光刻掩膜保护不需合成的部位，暴露合成部位，光作用下去除羟基上的保护基团，利用化学反应加上第一个核苷酸，所加核苷酸种类及在芯片上的部位预先设定，所引入的核苷酸带有光敏保护基团，以便下一步合成。同样方法在其他位点加上另3种核苷酸完成第一位核苷酸的合成。该法制作的芯片微探针密度可以达到10⁶/cm²，即探针间隔为5～10μm。

图3-9　光导原位合成法

②原位喷印合成：芯片原位喷印合成原理类似于喷墨打印，不过芯片喷印头和墨盒有多个，墨盒中装的是四种碱基等液体。喷印头可在整个芯片上移动，并根据芯片上不同位点探针的序列需要将特定的碱基喷印在芯片上特定位置。化学原理与传统的DNA固相合成一致。

③点样法是将合成好的探针、cDNA或基因组DNA通过计算机控制的微阵列点样机点在芯片上。点样分子可以是核酸也可以是寡核酸。点样量约为5nl。

根据微阵列上探针的种类，可将基因芯片分为寡核苷酸芯片和cDNA芯片。寡核苷酸芯片是将寡核苷酸原位合成或合成后固定在芯片上，并与标记样本DNA杂交，根据杂交信号出现部位的寡核苷酸序列，推测与其互补的DNA序列。可用于基因发现、突变检测、表达监控和遗传制图等。cDNA芯片是将cDNA固定在芯片上，并与一组标记探针杂交，可用于基因表达的研究。

（2）待测样本制备

①直接从组织细胞中分离纯化DNA，并对DNA进行特异扩增；或从组织细胞中提纯RNA，并进行逆转录以及cDNA扩增。在DNA扩增的过程中对样本进行标记。目前样品标记常采用荧光标记法，也可用生物素或放射性同位素标记。

②对标记后的样品进行纯化，以减小荧光背景对杂交信号检测的影响。

（3）杂交反应

基因芯片的分子杂交与southern印迹的方法一致。由于探针是附着在基因芯片的表面，会干扰靶分子与探针的结合，因此需要相应地延长杂交时间或增加靶分子的浓度。杂交反应条件必须根据探针的长度、类型以及GC含量等调整杂交液的盐浓度、杂交温度以及时间。

（4）信号检测和分析

基因芯片的杂交信号检测和分析需要高灵敏度的检测系统——阅读仪及其分析软件。根据成像原理的不同，阅读仪可分为激光共聚焦扫描和CCD两种。前者分辨率和灵敏度较高，可获取高质量的图像和数据，但扫描速度较慢，而且价格昂贵。后者的特点与之相反。目前常用的是激光共聚焦扫描仪。

基因芯片杂交实验可以产生成千上万个点的杂交信息，因此需要生物信息学手段的支持。借助读取和分析杂交信号的应用软件以及与网络公共数据库连接进行数据分析的应用软件，可以高效获得研究对象的有效信息。

杂交反应后芯片上各反应点的荧光位置、荧光强弱可用计算机控制的高分辨荧光扫描仪可获得。

样品与探针的错配是影响杂交反应结果的重要因素，但由于样品与芯片上的探针正确配对时产生的荧光信号要比错配时强的多，因此，通过对信号强度的分析，就可以区分正确与错误的配对。(www.chuimin.cn)

根据扫描结果，通过计算机软件处理即可给出目的基因的结构或表达信息。

图3-10　检测结果示意图

4.基因芯片的应用

（1）基因表达分析

发现和研究新基因可以从分子水平探求细胞生长代谢的调控机制，揭示基因突变诱导人类疾病的病因以及发生机理。基因芯片技术是基因筛选的有效方法，一般认为，基因芯片法比传统检测法灵敏度高10倍，而且可以检测低丰度表达水平的mRNA。

（2）基因突变检测

基因芯片是检测基因突变高效的手段。经典的研究多采用PCR-SSCP、手工或自动测序、异源双链分析、蛋白截短检测等方法，其缺点为步骤烦琐、工作量大、工作效率较低，限制了在大规模研究中的应用。基因芯片方法可以克服以上的不足，结合DNA聚合酶或连接酶，可进一步提高分辨率。

（3）药物筛选

筛选、分离和鉴定药的有效成分是目前中药产业和传统的西药开发的重要方向。基因芯片技术为大规模筛选药物提供了有效的手段，并能够从基因水平揭示药物的作用机理。应用基因芯片技术不仅能够分析用药前后机体的不同组织、器官基因表达的差异，而且可以利用RNA或单链DNA与靶蛋白质结合形成蛋白质-RNA或蛋白质-DNA复合物的特点，筛选特异的药物蛋白或核酸。

（4）基因芯片在其他领域中的应用

随着人类基因组计划（HGP）的完成，人类医学将从群体医学向个体医学过度。由于每个个体的遗传背景不同，其对临床治疗将有新的要求，即因人而治。由于不同患者对药物的敏感性存在差异，确定患者与药物代谢相关的基因多态性极为重要，基因芯片为患者的基因多态研究提供了高通量的测试手段。另外，基因芯片也是诊断同种疾病不同病原体的有效手段。

例如乙肝有多种亚型，HBV基因在S、P及C基因区易发生变异。利用乙肝病毒基因多态性检测芯片进行检测，可以指导临床用药，以及防止乙肝病毒耐药性，因此具有临床指导意义。

在生物体的细胞内，存在着几千至数万个基因。不同基因间的关系错综复杂，一个基因表达的上调或者下调均会影响上游和下游几个基因表达的改变，从而进一步引起与该几个基因相关的更多基因表达的改变。生物信息学在分析基因相互关系的网络中扮演至关重要的角色。基因芯片技术为生物信息的建立提供了高速、并行采集和分析的技术平台，成为基因组信息学研究的主要技术支撑。

5.基因芯片研究相关网站

（1）http://www.microarrays.com/

（2）http://www.microarrays.org/

（3）http://www.gene-chips.com/

（4）http://www.genesifter.net/

（5）http://www.dnaarrays.org/

（6）http://research.nhgri.nih.gov/microarray/index.html

（7）http://industry.ebi.ac.uk/~alan/MicroArray/

（8）http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/