单克隆抗体的制备、纯化和鉴定的实验成果

实验十　单克隆抗体的制备、纯化及鉴定

抗体是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法，由此获得的抗血清中通常还会含有针对其他无关抗原的抗体以及血清中的其他蛋白质成分。因而，常规血清抗体又称多克隆抗体（polyclonal antibody），简称多抗。由于常规抗体的多克隆性质，以及不同批次的抗体制剂质量差异很大，从而不利于其应用。因此，需要制备针对特定抗原、同时保证其无限供应的特异性均质抗体来满足应用的要求。

1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术，他们把用特定抗原免疫的小鼠脾细胞与能在体外培养中能无限生长的骨髓瘤细胞融合，形成B细胞杂交瘤。这种杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征，既能像骨髓瘤细胞一样在体外培养中无限地快速增殖且永生不死，又能像脾淋巴细胞一样合成和分泌特异性抗体。通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞的针对同一抗原决定簇的高度同质的抗体，即所谓单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb），简称单抗。

与多抗相比，单克隆抗体的理化性状高度均一，生物活性单一，与抗原结合的特异性强，便于人为处理和质量控制，而且来源容易、能持续无限量供应。在医学领域中，McAb在疾病诊、防、治以及疾病机制研究等方面起着巨大的促进作用。

1.实验目的

理解并掌握单克隆抗体制备的原理、主要步骤和方法。

2.实验原理

抗原免疫的B淋巴细胞能产生特异性抗体，但在体外不能无限增殖；骨髓瘤细胞在体外培养能大量无限增殖，但不能分泌特异性抗体；将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合后形成的杂交瘤细胞，继承了两个亲代细胞的特性，既具有骨髓瘤细胞能无限制增殖的特性，又具有免疫B细胞合成和分泌特异性抗体的能力。经在HAT培养基[含有次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷（T）]中进行选择性培养，未融合的脾细胞因不能在体外长期存活而死亡；未融合的骨髓瘤细胞合成DNA的主要途径被培养基中的氨基蝶呤阻断，又因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶（HGPRT），不能利用培养基中的次黄嘌呤完成DNA的合成过程而死亡。只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了HGPRT，因此能在HAT培养基中存活和增殖。经过克隆选择，可筛选出能产生特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞，在体内或体外培养，即可无限制地大量制备单克隆抗体。

图3-7　单克隆抗体的制备过程示意图

3.实验器材

细胞培养板、解剖器械、平皿、酶标仪、加样器、细胞计数板、CO2培养箱、倒置显微镜、离心机等。

4．操作方法

（1）抗原制备

制备单克隆抗体的免疫抗原，对纯度要求不是很高，但高纯度的抗原会增加得到所需单抗的机会，同时可以减轻筛选的工作量。一般来说，抗原的来源有限，或性质不稳定、提纯时易变性，或其免疫原性很强，或所需单抗是用于抗原不同组分的纯化或分析等。免疫用的抗原只需初步提纯甚至不提纯，但如抗原中混杂物很多，特别是如果这些混杂物的免疫原性较强时，则必须对抗原进行纯化。

（2）选择免疫动物

根据所用的骨髓瘤细胞可选用小鼠和大鼠作为免疫动物。供杂交瘤技术用的所有小鼠骨髓瘤细胞系均来源于BALB/c小鼠，所有大鼠骨髓瘤细胞系都来源于LOU/c大鼠，所以一般的杂交瘤生产都用这两种纯系动物作为免疫动物。当为了特殊目的而需进行种间杂交时，则可免疫其他动物。种间杂交瘤一般分泌抗体的能力不稳定，因为染色体容易丢失。就小鼠而言，初次免疫时以8～12周龄为宜，雌性鼠较便于操作。

（3）确定免疫程序

免疫是单抗制备过程中的重要环节之一，其目的在于使B淋巴细胞在特异抗原刺激下分化、增殖，以利于细胞融合，增加获得能分泌特异性抗体的杂交瘤细胞的机会。因此在设计免疫程序时，应考虑到抗原的性质、抗原的纯度、抗原量、免疫途径、免疫次数与间隔时间、佐剂的应用及动物对该抗原的应答能力等因素。

现用的免疫程序中多数是参照制备常规多克隆抗体的方法。采用的免疫途径通常是体内免疫法，包括皮下注射、腹腔或静脉注射，也采用足垫、皮内、滴鼻或点眼。最后一次加强免疫多采用腹腔或静脉注射，尤为推崇后者，可使抗原对脾细胞作用更加迅速而充分。在初次免疫和再次免疫应答反应中，取脾细胞与骨髓瘤细胞融合，特异性杂交瘤的形成高峰分别为第4天和第22天，在初次免疫应答时获得的杂交瘤主要分泌IgM抗体，再次免疫应答时获得的杂交瘤主要分泌IgG抗体。阳性杂交瘤出现的高峰多在血清抗体高峰之前，为达到最高的杂交瘤形成率需要有尽可能多的浆母细胞，因此在最后一次加强免疫后第3天取脾进行融合较适宜。也可采用脾内免疫，能提高小鼠对抗原的免疫反应性，且节省时间，一般免疫3天后即可融合。

A.可溶性抗原：以1～5mg/ml的溶液加等量的弗氏完全佐剂乳化，分多点小鼠皮下注射，总量为0.3～0.6ml，间隔3～5周再同样注射一次，10天后，断尾取血一滴，测抗体效价，选滴度高的小鼠做融合试验。一个月后可以经静脉（尾静脉）给予无佐剂抗原0.2～0.4ml，3～4天后，杀死小鼠取脾做融合用。

B.颗粒性抗原如抗原来源方便，可以不加佐剂而增加免疫次数，缩短间隔时间。例如用羊红细胞免疫小白鼠，以1%浓度每只皮下注射0.2ml，每周2次，共免疫5～8次，取脾前3天，再免疫一次即可。有人认为最后一次免疫剂量要大，大到近于免疫耐受的程度更好。

上述体内免疫法适用于免疫原性强、来源充分的抗原，对于免疫原性很弱或对机体有害（如引起免疫抑制）的抗原就不适用了。如果制备人单克隆抗体几乎不采用体内免疫法，可采用体外免疫。所谓体外免疫就是将脾细胞（或淋巴结细胞，或外周血淋巴细胞）取出体外，在一定条件下与抗原共同培养，然后再与骨髓瘤细胞进行融合。其基本方法是：

①取4～8周龄BALB/c小鼠的脾脏，制成单细胞悬液。

②用无血清培养液洗涤2～3次，悬浮于含10%小牛血清的培养液中。

③加入适量抗原，可溶性抗原0.5～5μg/ml，细胞抗原10⁵～10⁶个细胞/ml。

④加一定量的BALB/c小鼠胸腺细胞培养上清液，在37℃，5%CO₂浓度下培养3～5天，分离脾细胞。

（4）免疫脾细胞、骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备

A.实验试剂

①不完全RPMI-1640培养基RPMI-1640培养基原液96mlL-谷氨酰胺（L.G.）溶液（100×，0.2mol/L）1ml双抗溶液1ml7.5%NaHCO₃溶液1～2ml

HEPES溶液1ml

调节pH至7.2～7.4，过滤除菌，分装4℃保存。

②不完全DMEM培养基，DMEM13.37g，超纯水或四蒸水980ml，NaHCO₃3.7g，双抗溶液10ml，L-谷氨酰胺（L.G.）溶液（100×，0.2mol/L）10ml，用1NHCl调试pH至7.2～7.4，过滤除菌，分装4℃保存。

③完全RPMI-1640或DMEM培养基不完全RPMI-1640或DMEM培养基80ml小牛血清15～20ml用于骨髓瘤细胞SP2/0和建株后的杂交瘤细胞培养。

④HAT培养基完全RPMI-1640或DMEM培养基98mlHT贮存液1mlA贮存液1ml。

B.免疫脾淋巴细胞的制备

①取免疫过的血清抗体滴度高的Balb/c小鼠，颈椎脱臼或用CO₂处死小鼠。

②将小鼠放于75%酒精中浸泡5分钟，取出固定于解剖板上，在无菌条件

下取出脾脏，置于已盛有10ml不完全培养基的平皿中，冰浴下轻轻洗去脾上的红细胞，并小心剥去周围结缔组织。

③用弯头镊子或装在1ml注射器上的弯针头轻轻挤压脾脏，使脾细胞进入平皿中的不完全培养基，用吸管吹打数次，制成单细胞悬液。

④将悬液移入小试管中，直立小试管3分钟，使大块的结缔组织下沉，把细胞悬液移入离心管中。

⑤1000r/min离心5～10分钟，用不完全培养基离心洗涤1～2次（与此同时应开始制备骨髓细胞）。

⑥将细胞重悬于10ml不完全培养基混匀。

⑦加锥虫蓝染液用相差显微镜做活细胞计数后备用，活细胞数应高于80%为合格。

C.骨髓瘤细胞的制备

选择骨髓瘤细胞的条件：①该瘤细胞系的来源应与制备脾细胞小鼠为同一品系，以便两者的组织相容性抗原一致，以提高杂交融合率，便于接种杂交瘤在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb；②骨髓瘤细胞必须是静息状态，不产生γ球蛋白或不分泌到细胞外；③骨髓瘤细胞生长需要一个较高的细胞密度，最好10⁶/ml；④生长速度快，繁殖时间短。

融合前骨髓瘤细胞维持的方式，对成功地得到杂交瘤是最为重要的。目标是使细胞处于对数生长的时间尽可能长，融合前肯定不能少于1周。冻存的细胞在复苏后要2周时间才能处于适合于融合的状态，长过了的骨髓瘤细胞至少几天才可能恢复。在实验室中处于对数生长的骨髓瘤细胞维持在含10%小牛血清的培养基中，方法是用6个装5ml培养基的培养瓶，接种10倍系列稀释的骨髓瘤细胞。1周后到细胞相当密而又未长过的一瓶重新移植。典型的倍增时间为14～16小时。

常用的Balb/c小鼠产生的骨髓瘤细胞株有：①S194/5.XXO.BU.1；②SP2/0-Ag14（SP2/0)；③P3/X63-Ag8.653（X63-Ag8.653)；④F0等。

骨髓瘤细胞悬液的制备方法如下：

①于融合前36～48小时，将骨髓瘤细胞扩大培养（一般按一块96孔板的融合试验，约需2～3瓶100ml培养瓶培养的细胞进行准备）。

②融合当天，用弯头滴管将细胞从瓶壁轻轻吹下，收集于50ml离心管或融合管内。

③1000r/min离心5～10分钟，弃上清。

④加入30ml不完全培养基，同法离心洗涤一次。然后将细胞重悬于10ml不完全培养基，混匀。

⑤取骨髓瘤细胞悬液，加0.4%台盼蓝染液做活细胞计数后备用。细胞计数时，取细胞悬液0.1ml加入0.9ml台盼蓝染液中，混匀，用血球计数板计数。计算细胞数目的公式为：每毫升细胞数=4个大方格细胞数×10⁵/4；或每毫升细胞数=5个中方格细胞数×10⁶/2。

D.饲养细胞（Feedercells）的制备

在细胞融合后选择性培养过程中，由于大量骨髓瘤细胞和脾细胞相继死亡，此时单个或少数分散的杂交瘤细胞不易存活，通常必须加入其他活细胞使之繁殖，这种被加入的活细胞称为饲养细胞（Feedercells）。饲养细胞促进其他细胞增殖的机制一般认为它们可能释放非种属特异性的生长刺激因子，为杂交瘤细胞提供必要的生长条件；也可能是为了满足新生杂交瘤细胞对细胞密度的依赖性。

常用的饲养细胞有胸腺细胞、正常脾细胞和腹腔巨噬细胞。其中以小鼠腹腔巨噬细胞的来源及制备较为方便，且有吞噬清除死亡细胞及其碎片的作用，因此使用最为普遍。其制备方法如下：

①颈椎脱臼处死小鼠。

②75%酒精浸泡消毒10分钟。

③用手术剪从后腹掀起腹部皮肤，暴露腹膜，用酒精棉球擦拭腹膜消毒，用注射器注射10ml不完全培养基至腹腔，注意避免穿入肠管。

④右手固定注射器，使针头留置在腹腔内，左手持酒精棉球轻轻按摩腹部1分钟，随后回抽腹腔液体，加入离心管。

⑤1000r/min离心10分钟，弃上清。

⑥先用5mlHAT培养基将沉淀细胞悬浮，根据细胞计数结果，补加HAT培养基，使细胞浓度为2×10⁵/ml，备用。

⑦以1ml吸管将细胞种入微量培养皿，每孔0.1ml，含2万个细胞，放入CO₂培养箱培养，即可供细胞融合和克隆化之用。如果在融合后发现在培养孔中饲养细胞数量少，则可以在细胞换液时再加入一些。

附录：相关试剂的配制

①氨基蝶呤（A）贮存液（100×，4×10^-5mol/L）

称取1.76mg氨基蝶呤（AminopterinMW440.4），溶于90ml超纯水或四蒸水中，滴加1mol/LNaOH0.5ml中和，再补加超纯水或四蒸水至100ml。过滤除菌，分装小瓶（2ml/瓶），-20℃保存。

②次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷（HT）贮存液（100×，H：10^-2mol/L，T：1.6×10^-3mol/L)称取136.1mg次黄嘌呤（Hypoxanthine,MW136.1)和38.8mg胸腺嘧啶核苷（Thymidine,MW242.2)，加超纯水或四蒸水至100ml，置45℃～50℃水浴中使完全溶解，过滤除菌，分装小瓶（2ml/瓶），-20℃冻存。用前可置37℃加温助溶。

③L-谷氨酰胺（L.G.）溶液（100×，0.2mol/L）

称取2.92gL-谷氨酰胺（L-glutamine，MW146.15），用100ml不完全培养液或超纯水（或四蒸水）溶解，过滤除菌，分装小瓶（4～5ml/瓶），-20℃冻存。

④青、链霉素（双抗）溶液（100×）

取青霉素G（钠盐）100万单位和链霉素（硫酸盐）1g，溶于100ml灭菌超纯水或四蒸水中，分装小瓶（4～5ml/瓶），-20℃冻存。

⑤7.5%NaHCO₃溶液

称取分析纯NaHCO₃7.5g，溶于100ml超纯水或四蒸水中，过滤除菌，分装小瓶（4～5ml/瓶），盖紧瓶塞，4℃保存。

⑥HEPES溶液（1mol/L）

称取23.83gHEPES（N-2-Hydroxyethylpiperazine-N，-2-ethanesulfonicacid，N-2-羟乙基哌嗪-N，-2-乙基磺酸，MW238.3）溶于100ml超纯水或四蒸水中，过滤除菌，分装小瓶（4～5ml/瓶），4℃保存。

⑦8-氮鸟嘌呤贮存液（100×）

称取200mg8-氮鸟嘌呤（8-azaguanine，MW152.1），加入4mol/LNaOH1ml，待其溶解后，加入超纯水或四蒸水99ml，过滤除菌；分装小瓶，-20℃冻存。使用时按1%浓度加入到培养液中（即终浓度为20μg/ml）。

（5）细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养

A.实验试剂

①HT培养基

完全RPMI-1640或DMEM培养基99ml。

HT贮存液1ml。

②HAT培养基

完全RPMI-1640或DMEM培养基98ml。

HT贮存液1ml。

A贮存液1ml。

③50%PEG

称取20～50gPEG1000或4000于三角瓶中，盖紧，60℃～80℃水浴融化，分装于青霉素小瓶中，每瓶0.6ml，盖紧，121℃高压蒸汽灭菌15分钟，-20℃存放备用。临用前加热融化，加等量不完全培养基，用少许7.5%NaHCO₃调pH至8.0。或购买Sigma或Gibco公司现成产品。

B.细胞融合

①将1×10⁸脾细胞与2～5×10⁷骨髓瘤细胞SP2/0-Ag14混合于一支50ml融合管中，补加不完全培养基至30ml，充分混匀。

②1000r/min离心5～10分钟，弃上清，尽可能除得干净，用手指轻叩离心管底部，使沉淀细胞松散均匀，然后将离心管置37℃水中进行预热（一小烧杯中），准备融合。

③将在37℃水浴中保温的50%PEG1.0ml用滴管缓慢滴入离心管中，60秒内滴完，在37℃水浴中边滴边摇离心管，使细胞保存在混匀状态。

④加完PEG后，将细胞悬液置于37℃水浴中静置90秒，立即在2～4分钟内加入15ml预热至37℃的无血清RPMI-1640培养基，开始要一滴一滴地加，由于稀释使PEG停止作用。注意尽可能不搅动细胞。20℃～37℃静置10分钟。

⑤1000r/min离心5分钟，弃上清。

⑥加入5mlHAT培养基，轻轻吹吸沉淀细胞，使其悬浮并混匀，然后补加含腹腔巨噬细胞的HAT培养基至80～100ml。

⑦分装96孔细胞培养板，每孔0.10～0.15ml；分装24孔板，每孔1.0～1.5ml；然后将培养板置37℃，5%CO₂培养箱内培养。

⑧5天后用HAT培养基换出1/2培养基。

⑨7～10天后用HT培养基换出HAT培养基（第14天后可用普通完全培养基）。

⑩经常观察杂交瘤细胞生长情况，待其长至孔底面积1/10以上时吸出上清供抗体检测。

（6）杂交瘤细胞的筛选

杂交瘤细胞在融合后2周左右即可筛选，即把分泌所需抗体的杂交瘤孔从众多的孔中选出来，通常也称为抗体检测。检测抗体的方法应根据抗原的性质、抗体的类型不同，选择不同的筛选方法，一般以快速、简便、特异、敏感的方法为原则。

常用的方法有：①放射免疫测定（RIA）：用于可溶性抗原、细胞McAb的检测；②酶联免疫吸附试验（ELISA）：用于可溶性抗原、细胞和病毒等McAb的检测；③免疫荧光试验：适合于细胞表面抗原的McAb的检测；④间接血凝试验、细胞毒性试验、旋转黏附双层吸附试验等。

A.实验试剂及材料

①缓冲液

a.包被缓冲液

碳酸盐缓冲液：取0.2mol/LNa₂CO₃8ml，0.2mol/LNaHCO₃17ml混合，再加75ml蒸馏水，调pH至9.6。

Tris-HCl缓冲液（PH8.0，0.02mol/L）：取0.1mol/LTris100ml，0.1mol/LHCl58.4ml混合，加蒸馏水至1000ml。

b.洗涤缓冲液（pH7.2的PBS）

KH₂PO₄0.2g，KCl0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O2.9g，NaCl8.0g，Tween-200.5ml，加蒸馏水至1000ml。

c.底物缓冲液（pH5.0，磷酸盐—柠檬酸缓冲液）

取0.2mol/LNa₂HPO₄25.7ml，0.1ml/L柠檬酸24.3ml，再加50ml蒸馏水。柠檬酸溶液及配成的底物缓冲液不稳定，易形成沉淀，因此一次不宜配制过多。

②稀释液和封闭液

牛血清白蛋白（BSA）0.1g，加洗涤液至100ml；或用洗涤液将小牛血清配成5%～10%使用。

③酶反应终止液（2mol/LH₂SO₄）

取蒸馏水178.3ml，滴加浓硫酸（98%）21.7ml。

④底物使用液

a.OPD底物使用液（测490nm的OD值）：OPD5mg，底物缓冲液10ml，3%H₂O₂0.15ml。

b.TMBS或TMB底物使用液（测450nm的OD值）：TMBS或TMB（1mg/ml）1.0ml，底物缓冲液10ml，1%H₂O₂25μl。

c.ABTS底物使用液（测410nm的OD值）：ABTS0.5mg，底物缓冲液1ml，3%H₂O₂2μl。

⑤抗体对照

以骨髓瘤细胞培养上清作为阴性对照，以免疫鼠血清作为阳性对照。

⑥抗原

可溶性抗原尽量纯化，以获得高特异性；病毒感染的传代细胞或全菌抗原；淋巴细胞等悬液。

⑦酶标抗鼠抗体或酶标SPA或其他类似试剂。

⑧细胞固定液：-20℃丙酮；或丙酮—甲醛固定液（1∶1）：Na₂HPO₄100mg，KH₂PO₄500mg，蒸馏水150ml，丙酮225ml，甲醛125ml；或-20℃甲醇。

⑨聚苯乙烯微孔板：40孔、96孔或条孔；硬板或软板均可使用。

⑩吸管、加样器等。

B.放射免疫测定（RIA）

放射免疫测定是用放射性同位素标记抗原或抗体，以检测相应抗原或抗体的定量方法。在筛选和鉴定单抗时常采用抗原固相法，即用抗原包被聚乙烯微板，由此检测样品中的McAb，其操作步骤如下：

①用碳酸盐缓冲液将抗原稀释至适宜的浓度（1～100μg/ml），滴加聚乙烯微板孔内，100μl/孔，4℃过夜或37℃2小时。

②弃去抗原液，每孔加100μl含0.5%～1%BSA的PBS，4℃封闭1～2小时。

③用BSA-PBS洗涤3次，每次3分钟。

④加待检样品，每孔100μl，同时设立阴性对照孔、阳性对照孔和空白孔；37℃放置1-2小时，同法洗涤。

⑤每孔加125I标记的抗鼠Ig抗体工作液100μl，37℃，1～2小时，同法洗涤。

⑥用γ-射线闪烁计数仪分别测定各孔放射性。通常要求样品孔和阳性对照孔的放射性脉冲分别超过本底5倍和10倍。若以空白孔的放射性为基准，凡样品孔与阴性对照孔放射性之比大于3的样品定为阳性。

C.酶联免疫吸附试验（ELISA）

依据抗原类型的不同，其具体操作方法不同。

a.可溶性抗原的ELISA

①纯化抗原用包被液稀释至1～20μg/ml。

②将抗原稀释液加入酶标板孔中，每孔50～100μl，置4℃过夜或37℃吸附2小时。

③弃去孔内的液体，同时用洗涤液洗3次，每次3～5分钟，拍干。

④每孔加200μl封闭液，4℃过夜或37℃封闭2小时。某些抗原可省略该步骤。

⑤用洗涤液洗3次。此时包被板可于-20℃或4℃保存备用。

⑥每孔加50～100μl待检杂交瘤细胞培养上清，同时设立阳性、阴性对照和空白对照，37℃孵育1～2小时，洗涤，拍干。

⑦加酶标第二抗体，每孔50～100μl，37℃孵育1～2小时，洗涤，拍干。

⑧加底物使用液，每孔加新鲜配制的底物使用液50～100μl，37℃，10～30分钟。

⑨以2mol/LH₂SO₄终止反应，在酶联免疫检测仪上读取OD值。

⑩结果判定：以P/N≧2.1为阳性。若阴性对照孔无色或接近无色，阳性对照孔明确显色，则可直接用肉眼观察结果。

b.全细胞抗原的ELISA

①按常规方法培养细胞，接种病毒，收获感染细胞和未感染细胞，进行细胞计数，用PBS制成适当浓度的细胞悬液。

②淋巴细胞悬液的制备：采用新鲜外周血加肝素抗凝后，滴加于淋巴细胞分离液之上，1500rpm/min离心30分钟，吸取界面细胞洗涤2次，即制得新鲜淋巴细胞悬液。该细胞悬液中若仍混有红细胞，离心后加0.83%的氯化铵溶液，室温放置10分钟，洗涤一次即可。然后将该细胞悬液稀释至适当浓度。

③在酶标板中每孔加100μl上述a或b的细胞悬液，使每孔含细胞5×10⁴个；1500r/min离心15分钟，甩去上清；室温干燥或吹干后用丙酮-甲醛（1∶1）4℃固定10分钟；可于4℃或-20℃保存备用。

④以下步骤同上法。

c.全菌抗原的ELISA

①新鲜培养的细菌用蒸馏水或PBS悬浮，调整细菌浓度至1×10⁸/ml。对于人畜共患病病原体需注意安全操作，最好是灭活处理。

②在酶标板每孔中加100μl5%戊二醛溶液（0.1mol/LNaHCO₃95ml，25%戊二醛溶液5ml），37℃作用2小时，蒸馏水洗涤3次。

③在每孔中加上述细菌悬液50μl，37℃～56℃烘干后，每孔加200μl封闭液，4℃过夜封闭或37℃封闭2小时。

④洗涤液洗3次；此时包被板可在-20℃或4℃保存备用。

⑤以下步骤同上法。

d.抗体捕捉ELISA

该法是常用的ELISA中较理想的一种。其应用抗BALB/c小鼠Ig的多克隆抗体来捕捉待检样品中的McAb，再依次加抗原、酶标多克隆抗体及底物进行显色。其操作步骤如下：

①以适当浓度的纯化抗鼠Ig抗体包被酶标板，每孔加100μl，37℃2小时或4℃过夜。

②洗涤、拍干后加待测的McAb样品，37℃，1～2小时。

③洗涤，加适量抗原，37℃，1～2小时。

④洗涤，加入酶标多克隆抗体，37℃，1～2小时。

⑤洗涤，加底物显色，判定结果。

e.ABC-ELISA

ABC-ELISA是在常规ELISA原理的基础上，增加了生物素（Biotin）与亲和素（Avidin）间的放大作用。亲和素由4个亚单位组成，对生物素有高度的亲和力，生物素很易与蛋白质共价结合。因此，结合了酶的亲和素与结合有抗体的生物素发生反应即起到了多极放大作用。其操作步骤如下：

①已知抗原的包被及加待检McAb样品，与上述间接ELISA试验相同。

②加生物素化抗鼠Ig抗体，每孔100μl，37℃，1小时。

③洗涤，加酶标亲和素，每孔100μl，37℃，30分钟。

④洗涤，加底物显色，判定结果。

f.免疫斑点试验（Dot-ELISA)

Dot-ELISA是以硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜为固相载体，进行抗原抗体反应的免疫检测手段。该法采用不溶性底物（如DAB，4-氯萘酚或AgNO₃等）与相应标记物（HRP、AP、胶体金）作用形成不溶性产物，呈现斑点状着色，从而易于判定结果。根据所用的标记物不同，可分为HRP免疫斑点试验、AP免疫斑点试验和免疫金银斑点法等。其操作步骤如下：

①将2～5μl抗原液点加于纤维素膜上，室温或37℃干燥。

②将纤维素膜浸入封闭液中，37℃，30分钟。

③用洗涤液洗2次，吸干后加待检McAb样品，37℃，1小时；

④用洗涤液振荡洗涤3次，每次5分钟，加HRP、或AP、或胶体金标记的抗鼠Ig抗体，37℃作用30分钟。

⑤同法洗涤，吸干，用新配的相应底物溶液显色，然后水洗终止反应，观察结果。

D.免疫荧光技术

免疫荧光技术可用于多种抗原的杂交瘤抗体检测，如细胞性抗原（包括细菌和动物细胞）、感染细胞中的病毒抗原和膜抗原等。其具有操作简单、敏感性高、可直接观察抗原定位等优点。间接免疫荧光法操作步骤如下：

①固定细胞片的制备：生长在盖片上的细胞（接种或未接种病毒），PBS洗涤，丙酮4℃固定10分钟，空气干燥，置密封容器于-20℃保存备用；单细胞悬液可在盖片上制成涂片，然后用上述方法固定。

②用去离子水湿润盖片，然后置架上滴加10～20μl杂交瘤上清或其他待检样品；设立阳性、阴性对照；置37℃水浴孵育0.5～1小时。

③取出盖片置PBS中用磁力搅拌器洗涤15分钟。

④取出盖片，滴加工作浓度的抗鼠Ig的荧光抗体10～20μl，37℃孵育0.5～1小时。

⑤按照③方法洗涤15分钟，取出盖片，用延缓荧光淬灭的封载剂（如缓冲甘油，9份甘油加1份PBS）封于干净载玻片上。

⑥在荧光显微镜上观察，阳性结果可见特异性荧光（FITC为黄绿色荧光，TRITC为橘红色荧光）。

图3-8　阳性结果示例图

E.间接血凝试验

间接血凝试验又称被动血凝试验（PHA），是目前应用较广的检测方法之一。本试验是以包被可溶性抗原的红细胞作为指示系统，当被检抗体与包被在红细胞上的抗原产生特异性反应时，导致红细胞呈凝集现象。该法具有灵敏、快速、容易操作和无需昂贵仪器等优点，而且经改用醛化红细胞以后，可克服原来重复性差的缺点。多糖抗原的间接血凝试验步骤如下：

①甲醛化绵羊红细胞的制备

a.无菌采集绵羊颈静脉血50ml，以枸橼酸钠作抗凝剂。用5倍于红细胞体积的pH7.2 PBS缓冲液充分洗涤5次，每次1500r/min，5～10分钟，直至上清测定无蛋白质（用饱和硫酸铵滴定上清，观察有无白色沉淀）。

b.再以相同缓冲液配成25%红细胞悬液。

c.将25%红细胞悬液与20%甲醛以2.5∶1的比例混匀，37℃水浴作用2小时，每隔15分钟振荡一次，红细胞颜色逐渐由鲜红色转变为棕色。

d.以pH7.2PBS洗涤4次，每次2000r/min，10分钟，再以同样的PBS制成25%红细胞悬液。

e.重复醛化一次，方法同前。

f.最后配成20%醛化绵羊红细胞悬液，加甲醛至0.3%防腐，4℃保存备用。

②脂多糖抗原致敏甲醛化绵羊红细胞的制备

a.取脂多糖（LPS），以0.2mol/LpH8.0PBS调整多糖浓度至120μg/ml，然后于100℃水浴处理1小时，再冷却至37℃。

b.将冷却至37℃的LPS与6%醛化红细胞等量混合，37℃搅拌作用45分钟。

c.离心，2000r/min，10分钟，以0.01mol/LpH7.2PBS洗涤4次。

d.配制成4%致敏血球，分装，保存于4℃备用，或冻干保存。

③McAb的筛选

a.取待测McAb样品25μl，加入V型微量血凝板孔中，同时设立阴性、阳性对照。

b.加入0.5%～4%的致敏红细胞悬液25μl，在振荡器上混匀30秒。

c.置室温或37℃30～60分钟观察结果。阴性对照孔应呈紧缩的圆点。

（7）杂交瘤细胞的克隆化

杂交瘤细胞的克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。因为从原始孔中经过HAT筛选后得到的阳性杂交瘤细胞，可能来源于两个或多个杂交瘤细胞，可能包括特异性抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞以及其他无关抗体的分泌细胞，为了得到完全同质的单克隆抗体，必须对杂交瘤细胞进行克隆化。另外，杂交瘤细胞培养的初期是不稳定的，有的细胞丢失部分染色体，可能丧失产生抗体的能力，为了除去这部分已不再分泌抗体的细胞，得到分泌抗体稳定的单克隆杂交瘤细胞系（也称亚克隆）也需要进行克隆化。即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆，以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失，从而丧失产生抗体的能力。

所谓克隆化是指使单个细胞无性繁殖而获得该细胞团体的整个培养过程。克隆化的原则是：对于检测抗体阳性的杂交瘤细胞尽早进行克隆化，否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制，因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌细胞的生长速度快，二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丢失。通常在得到针对预定抗原的杂交瘤以后需连续进行2-3次克隆化，有时还需进行多次。

克隆化的方法很多，如有限稀释法、软琼脂法、单细胞显微操作法、单克隆细胞集团显微操作法和荧光激活细胞分类仪（FACS）分离法。最常用的是有限稀释法和软琼脂平板法。有限稀释法

⑴材料

①活力强的杂交瘤细胞。

②小鼠腹腔细胞。

③HT培养基。

④96孔细胞培养板。

⑵方法

①克隆前1天制备小鼠腹腔细胞（即饲养细胞)，同“细胞融合”中的方法。

②制备待克隆的杂交瘤细胞悬液，用含20%血清的HT培养基稀释至每毫升含2.5、15和50个细胞3种不同的稀释度。

③在上述杂交瘤细胞悬液中分别加入腹腔巨噬细胞，按每毫升5×10⁴~1×10⁵细胞的比例加入。

④每种杂交瘤细胞分装96孔板一块，每个稀释度32孔，每孔量为200μl，每孔的杂交瘤细胞数分别为0.5、3和10。

⑤在37℃、5%CO₂孵箱中湿润培养7～10天，出现肉眼可见的克隆即可检测抗体；在倒置显微镜下观察，标出只有单个克隆生长的孔，取上清作抗体检测。

⑥取抗体检测阳性孔的细胞移至24孔板中扩大培养，并尽快冻存。

⑦本法中②、③、④也可简化为将计数后的杂交瘤细胞准确地进行系列稀释，直至每毫升含10个细胞，按每孔接种0.1ml细胞悬液，即每孔含1个细胞。软琼脂法

⑴材料

①活力强的杂交瘤细胞。

②小鼠腹腔细胞。

③HT培养基（双倍浓度）。

④用0.15mol/LNaCl配制的2.0%琼脂糖：称取2.0g细胞培养用琼脂糖，悬浮于100ml 0.15mol/LNaCl，121℃高压灭菌15分钟，分装10ml小瓶，冷却后4℃保存。

⑤灭菌平皿。

⑥45℃水浴。

⑵方法

①在培养皿中制备饲养细胞（小鼠腹腔细胞）单层。

②临用前将2%琼脂糖生理盐水溶液与等量双倍浓度的HT培养液混匀，配成1%琼脂糖培养液，45℃水浴中温育。(www.chuimin.cn)

③吸去平皿上层培养液，加入1%琼脂糖培养液3ml，室温10分钟。

④取杂交瘤细胞悬液1ml，加入1%琼脂糖培养液1ml混匀，铺于上层。

⑤37℃、5%CO₂孵箱中湿润培养7～14天，克隆生长至2mm时，用毛细吸管吸出克隆，直接转种于含有饲养细胞的24孔板，扩大培养。

⑥吸取上清，检测抗体，阳性孔可继续克隆化，或扩大培养、冻存。

（8）杂交瘤细胞的冻存与复苏

杂交瘤细胞的冻存

及时冻存原始孔杂交瘤细胞每次克隆化得到的亚克隆细胞是十分重要的。因为在没有建立一个稳定分泌抗体的细胞系的时候，细胞在培养过程中随时可能发生细胞的污染、分泌抗体能力的丧失等等，如果没有原始细胞的冻存，则可因上述意外而前功尽弃。在杂交瘤细胞系建立以后，更需要冻存一大批，以备今后随时取用。细胞冻存的原理是细胞在加血清和二甲基亚砜的培养基中以一定的缓慢速度下降温度，可在-196℃液氮或液氮蒸气中长期保存。

①材料

a.含10%～20%血清、10%DMSO的HT培养基，冰浴降温至0℃左右，用作冻存液。

b.处于对数生长中期、健康而活力好的杂交瘤细胞。

c.灭菌的冻存管。

d.-70℃冰箱。

e.液氮及液氮罐。

②方法

a.将杂交瘤细胞离心，弃上清，重新悬浮于预冷的冻存液中，浓度为10⁶～10⁷/ml左右，分装于冻存管中，每管1ml，置冰浴上。

b.冻存管封口，管上标明细胞名称、冻存日期、批号等，然后仍置冰浴上。

c.将冻存管放入一带收口绳的小布袋内，布袋上标明冻存号、细胞名称等，然后置于-20℃冰箱1～2小时，再置-70℃冰箱。

d.2～4小时后或过夜后从-70℃冰箱取出，将盛有细胞的布袋移入液氮罐；在布袋的线绳上做好标记或代码；最后在液氮冻存簿上作详细记录。

⑵杂交瘤细胞的复苏

杂交瘤细胞、骨髓瘤细胞或其他细胞在液氮中保存，若无意外情况时，可保存数年至数十年。每年需复苏一次。复苏时融解细胞速度要快，使之迅速通过最易受损的-5℃～0℃，以防细胞内形成冰晶引起细胞死亡。

通常细胞复苏方法如下：

①从液氮中取出冻存管，立即在37℃水浴融化，应在1分钟内使细胞完全融化。

②用5～10mlHT培养基稀释，1000r/min离心10分钟。

③弃上清，再悬浮于适量HT培养基中，转入培养瓶或24孔板，置37℃，5%CO₂孵箱中培养。

④如果细胞存活力不高，死细胞太多，每毫升可加10⁴～10⁵小鼠腹腔细胞进行培养。（9）单克隆抗体的大量生产

获得稳定的杂交瘤细胞系后，即可根据需要大量生产单抗，以用于不同目的。

目前大量制备单抗的方法主要有两大系统，一是动物体内生产法，这是国内外实验室所广泛采用的；另一是体外培养法。

①动物体内生产法鉴于绝大多数杂交瘤细胞均由BALB/c小鼠的骨髓瘤细胞与同品系的脾细胞融合而得，因此使用的动物当然首选BALB/c小鼠。本方法即将杂交瘤细胞接种于小鼠腹腔内，在小鼠腹腔内生长杂交瘤，并产生腹水，因而可得到大量的腹水单抗且抗体浓度很高。该法操作简便、经济，不过腹水中常混有小鼠的各种杂蛋白（包括Ig），因此在很多情况下要提纯后才能使用，而且还有污染动物病毒的危险，故而最好用SPF级小鼠。

A.材料：

a.成年BALB/c小鼠。

b.处于对数生长期的杂交瘤细胞。

c.降植烷（Pristane）或液状石蜡。

B.方法：

a.腹腔接种降植烷或液状石蜡，每只小鼠接种0.3～0.5ml。

b.7～10天后腹腔接种经PBS或无血清培养基稀释的杂交瘤细胞，每只小鼠接种5×10⁵/0.2ml。

c.5天后开始观察小鼠腹水产生情况，每天进行观察，如腹部明显膨大，以手触摸时皮肤有紧张感，即可用16号针头采集腹水，一般可连续采2～3次，通常每只小鼠可采5～10ml腹水。

d.将腹水离心，2000r/min，5分钟，除去细胞成分和其他的沉淀物，收集上清，测定抗体效价，分装，-70℃冻存备用，或冻干保存。

②体外培养生产法

杂交瘤细胞系并不是严格的贴壁依赖细胞（anchoragedependentcell，ADC），因此既可以进行单层细胞培养，又可以进行悬浮培养。杂交瘤细胞的单层细胞培养法是最常用的手段，即将杂交瘤细胞加入培养瓶中，以含10%～15%小牛血清的培养基培养，细胞浓度以1～2×10⁶/ml为佳，然后收集培养上清，其中单抗含量约10～50μg/ml。显然，这种方法制备的单抗量极为有限，无疑是不适用于单抗的大规模生产。要想在体外大量制备单抗，就必须进行杂交瘤细胞的大量（高密度）培养。单位体积内细胞数量越多，细胞存活时间越长，单抗的浓度就越高，产量就越大。

目前在杂交瘤细胞的大量培养中，主要有两种类型的培养系统。其一是悬浮培养系统，采用转瓶或发酵罐式的生物反应器，其中包括使用微载体；其二是细胞固定化培养系统，包括中空纤维细胞培养系统和微囊化细胞培养系统。

A.悬浮培养法：目前小规模悬浮培养多采用转瓶培养，通过搅拌使细胞呈悬浮状态；而大规模悬浮培养多采用发酵式的生物反应器，美国、加拿大、法国和德国等几家公司生产这类反应器，其培养方式可分为纯批式、流加式、半连续式和连续式。

B.微载体培养法：微载体（Microcarrier）是以小的固体颗粒作为细胞生长的载体，在搅拌作用下，微载体悬浮于培养液中，细胞则在固体颗粒表面生长成单层。可用作细胞大量培养的微载体主要以交联琼脂糖或葡聚糖、聚苯乙烯、玻璃等作为基质的产品，其中以Cytodex I，Biosilon和Superbeads为好。微载体培养的方法基本上与悬浮培养相同。近来的研究表明，该法是杂交瘤细胞大量培养的理想途径之一。

C.中空纤维细胞培养系统：该系统由中空纤维生物反应器、培养基容器、供氧器和蠕动泵等组成。用于细胞培养的中空纤维由乙酸纤维、聚氯乙烯-丙烯复合物、多聚碳酸硅等材料制成，外径一般为100～500μm，壁厚25～75μm，壁呈海绵状，上面有许多微孔。中空纤维的内腔表面是一层半透明性的超滤膜，其孔径只允许营养物质和代谢废物出入，而对细胞和大分子物质（如单抗等）有滞留作用。目前使用的中空纤维生物反应器分为柱式、板框式和中心灌流式。尽管该培养系统在大规模生产单抗时成本较低，并可获得高产量高纯度的抗体，由于设备价格昂贵，限制了其使用范围。

D.微囊化细胞培养系统：该系统是先将杂交瘤细胞微囊化，然后将此具有半透膜的微囊置于培养液中进行悬浮培养，一定时间后，从培养液中分离出微囊，冲洗后打开囊膜，离心即可获得高浓度的单抗。

总之，上述四种体外培养生产单抗的方法仍处在发展之中，随着研究的不断深入和技术的完善，它们将会在单抗生产的产业化进程中发挥越来越大的作用。

③无血清培养杂交瘤细胞制备单抗

杂交瘤细胞的体外培养绝大多数应用DMEM或RPMI-1640为基础培养基，添加10%～20%胎牛或新生小牛血清。基础培养基主要提供各种氨基酸、维生素、葡萄糖、无机盐、各种合成核酸和脂质的前体物质。而血清主要供给杂交瘤细胞等各种营养成分，血清中的激素可刺激细胞生长，其中的许多蛋白质能结合有毒性的离子和热源质而起解毒作用，同时这些蛋白质对激素、维生素和脂类有稳定和调节作用。但是，血清中含有上百种的蛋白质，这给单抗的纯化带来很大麻烦，而未纯化的含有异种蛋白的单抗用于动物治疗可诱发变态反应；加之血清来源有限，每批血清之间质量差异又较大，直接影响结果的稳定性；同时血清是杂交瘤细胞发生支原体污染的最主要来源之一，而且价格较贵。为了克服血清的这些缺点，采用无血清培养基培养杂交瘤细胞越来越受到广泛重视。

无血清培养的实质就是用各种不同的添加剂来代替血清进行杂交瘤细胞的培养。目前已报道的各类无血清培养基有：含有大豆类脂的、含有酪蛋白的、化学限定性的、无蛋白的、含有血清低分子量成分的无血清培养基。其中一部分已有产品出售。约有几十种不同的添加剂可用于无血清培养基，在其中必须添加胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺和亚硒酸钠这四种成分，才能起到类似血清的作用，其他较重要的添加剂包括白蛋白、亚油酸和油酸、抗坏血酸以及锰等一些微量元素。

采用无血清培养基培养杂交瘤细胞制备单抗，有利于单抗的纯化，有助于大规模生产，可减少细胞污染的机会，且成本较低。但无血清培养细胞的生产率低、细胞密度小，影响了单抗的产量；同时无血清培养基还缺少血清中保护细胞免受环境中蛋白酶损伤的抑制因子等。尽管如此，无血清培养基终究会成为杂交瘤细胞培养的理想的培养基。

（10）单克隆抗体的纯化

辛酸-硫酸铵法纯化单克隆抗体

原理

蛋白质在溶液中的溶解度取决于蛋白质周围亲水基团与水形成水化膜的程度，以及蛋白质分子所带有的电荷。如改变这两个因素，蛋白质就容易沉淀析出。引起蛋白质沉淀的主要方法有①盐析：即加入大量中性盐破坏蛋白质的胶体稳定性而使其析出，沉淀不同蛋白质所需盐浓度及pH值不同；②生物碱试剂法：在pH值小于等电点时可以与蛋白质形成不溶的盐而使其沉淀；③重金属盐沉淀：在pH值大于等电点时可以与蛋白质结合成不溶的盐使其沉淀；④有机溶剂沉淀法：如酒精、甲醇、丙酮等，对水的亲和力很大，能破坏蛋白质水化膜，在等电点时使蛋白质沉淀。

辛酸（caprylicacid）在偏酸条件下能与血清或腹水中除IgG外的其他蛋白质结合并将其沉淀下来，IgG则溶于上清液中，再用硫酸铵盐析，即可达到纯化IgG的目的。辛酸—硫酸铵法是目前实验室中较常用的纯化单克隆抗体的方法，利用该方法纯化单克隆抗体的回收率和纯度都可达80%以上。

试剂和器材

①小鼠腹水

②硫酸铵或饱和硫酸铵溶液

称（NH₄）₂SO₄400～425g，以50℃~80℃500ml蒸馏水溶解，搅拌20分钟，趁热过滤，冷却后以浓氨水（15MNH₄OH）调pH值至7.4。配制好的饱和硫酸铵瓶底应有结晶析出。

③0.06mol/LpH4.8的醋酸盐缓冲液

贮存液：

A液（0.06mol/LNaAc)：无水NaAc0.49218g加蒸馏水至100ml。

B液（0.06mol/LHac)：冰醋酸0.344ml加蒸馏水至100ml。

应用液：取上述A液59ml与B液41ml昆合，用5mol/LNaOH调pH值至4.8。

④0.lmol/LpH7.4磷酸盐缓冲液（PBS)

取Na₂HPO₄·12H₂O28.94g，KH₂PO₄2.61g，加蒸馏水至1000m1。

⑤含137mmol/LNaCl、2.6mmol/LKCl、0.2mmol/LEDTA的pH7.4磷酸盐缓冲液（PBS)

取Na₂HPO₄·12H₂O28.94g，KH₂PO₄2.61g，NaC18.0g，KCl0.2g，EDTA0.06g，加蒸馏水至1000ml。

⑥普通冰箱、低温离心机、电磁搅拌器、紫外分光光度计、天平、透析袋、塑料夹、精密pH试纸、烧杯、量桶、吸管、滴管、小瓶等。

操作步骤

方案一硫酸铵沉淀法

①腹水的预处理

在单抗纯化之前，一般均需对腹水进行预处理，目的是为了进一步除去细胞及其残渣、小颗粒物质以及脂肪滴等。常用的方法有二氧化硅吸附法和过滤离心法，以前者处理效果为佳，而且操作简便。

A.二氧化硅吸附法：新鲜采集的腹水（或冻存的腹水），2000r/min15分钟，除去细胞成分（或冻存过程中形成的固体物质）等；取上层清亮的腹水，等量加入pH7.2巴比妥缓冲盐水（VBS：0.004mol/L巴比妥，0.15mol/LNaCl，0.8mmol/LMg²⁺，0.3mmol/LCa²⁺）稀释；然后以每10ml稀释腹水中加150mg二氧化硅粉末，混匀，悬液在室温孵育30分钟，不时摇动；2000g离心20分钟，脂质等通过该法除去，即可得澄清的腹水。

B.过滤离心法：用微孔滤膜过滤腹水，以除去较大的凝块及脂肪滴；用10000rpm15分钟高速离心（4℃）除去细胞残渣及小颗粒物质。

C.混合法：即上述两法的组合，先将腹水高速离心，取上清液再用二氧化硅吸附处理。

②取1份腹水与2份醋酸盐缓冲液混合，室温搅拌下逐滴加入正辛酸33μl/ml腹水。

③室温混合30分钟；4℃静置2小时以上，使其充分沉淀。

④4℃，12000rpm离心30分钟，弃沉淀。

⑤上清经砂芯漏斗或125μm的尼龙网过滤后加入1/10体积的0.1mol/LpH7.4PBS，用2mol/LNaOH调pH值至7.4。

⑥冰浴，30分钟内加入0.277g/ml的硫酸铵，使成45%饱和度。

⑦4℃静置1小时以上。

⑧4℃，10000rpm离心30分钟，弃上清。

⑨沉淀用适量含137mmol/LNaC1、2.6mmol/LKCl、0.2mmol/LEDTA的pH7.4PBS溶解，于50倍~100倍体积的上述PBS中4℃透析过夜。

⑩取少量透析后样品适当稀释后，以紫外分光光度计检测蛋白含量，SDS-PAGE检测抗体纯度。

方案二饱和硫酸铵溶液沉淀法

①~④同方案一。

⑤上清经砂芯漏斗或125μm的尼龙网过滤后于50倍体积的0.01mol/LpH7.4PBS中4℃透析6小时。

⑥在透析后的上清中加入等体积饱和硫酸铵溶液。

⑦4℃静置1小时以上。

⑧4℃，10000rpm离心30分钟，弃上清。

⑨沉淀用适量含137mMNaCl、2.6mMKC1、0.2mMEDTA的pH7.4PBS溶解，于50倍~100倍体积的上述PBS中4℃透析过夜。

⑩取少量透析后样品适当稀释后，以紫外分光光度计检测蛋白含量，SDS-PAGE检测抗体纯度。

注意事项

①无论是含有单克隆抗体的腹水还是细胞培养上清，均含有脂蛋白、脂质、细胞碎片等杂质，必须预先去除。通常采用过滤的方法去除脂质和大的颗粒，用离心的方法去除细胞碎片和大的蛋白聚合物，如果材料里含有大量脂质，还必须用二氧化硅粉或玻璃纤维吸附等将其去除。

②盐析时，溶液中的蛋白浓度对沉淀有双重影响。蛋白浓度愈高，沉淀所需的盐饱和度极限愈低，但杂蛋白的共沉作用也随之增加。因此在盐析时血清和腹水都应作适当稀释，一般血清作倍比稀释，腹水作2倍稀释。

③辛酸—硫酸铵法还可以用来纯化血清中的抗体，此时辛酸用量因抗体来源不同而稍有变化。人血清为70μl/ml，兔血清为75μl/ml，小鼠血清为40μl/ml。

④pH值对盐析的影响：抗体的溶解度与pH值和盐浓度有密切关系，选择适当的pH值可大大提高对单克隆抗体的沉淀效果。通常溶液的pH值与目标蛋白的等电点相等时，沉淀效果最好。另外，硫酸铵在水中显酸性，为防止对蛋白质的破坏，应将溶液的pH值调至中性。

⑤该法主要用于IgG1和IgG2b的纯化，对IgA和IgG3的回收率及纯化效果都较差。蛋白质经硫酸铵沉淀、离心分离后，沉淀中含有硫酸铵，在此状态下冷冻保存，蛋白质比较稳定。若需进一步处理，首先需要除盐，方法可选择透析，凝胶过滤等。

（11）单克隆抗体特性的鉴定

（11-1）单克隆性的确定

单克隆性的鉴定包括杂交瘤细胞的染色体分析、单抗免疫球蛋白重链和轻链类型的鉴定和单抗纯度鉴定等。

（11-1-1）杂交瘤细胞的染色体分析

杂交瘤细胞的染色体分析是判定其是否为真正的杂交瘤细胞的客观指标之一。杂交瘤细胞的染色体数目应接近两种亲本细胞染色体数目的总和。正常小鼠脾细胞的染色体数目为40，小鼠骨髓瘤细胞SP2/0为62-68，NS-1为54-64。同时骨髓瘤细胞的染色体结构上反映两种亲本细胞的特点，除多数为端着丝点染色体外，还出现少数标志染色体。同时，杂交瘤细胞的染色体分析对了解杂交瘤细胞分泌单抗的能力有一定的意义，一般来说，如杂交瘤细胞染色体数目较多且较集中，则其分泌单抗的能力高，反之，其分泌单抗能力则低。

秋水仙素法是杂交瘤细胞染色体分析的最常用方法，其原理是应用秋水仙素特异的破坏纺锤丝而获得中期分裂象细胞；再用0.075mol/LKCl溶液低渗处理，使细胞膨胀，体积增大，染色体松散；经甲醇-冰醋酸溶液固定，即可观察检查。

其操作步骤如下：

①将杂交瘤细胞传代，36～48小时后，用秋水仙素处理。

②秋水仙素处理：在培养瓶中加入秋水仙素（100μg/ml，除菌，-20℃保存），使最终浓度为0.1～0.4μg/ml（若改用秋水仙胺则最终浓度为0.02～0.05μg/ml），继续培养4～6小时，然后吹打细胞，移入离心管中，1000r/min离心10分钟，弃上清。

③加入已预热到37℃的0.075mol/LKCl溶液5ml，将沉淀细胞悬浮并混匀，37℃水浴15～20分钟。

④向悬液中加入新配制的固定液（甲醇与冰醋酸3∶1混合）1ml，混匀，然后1000r/min离心10分钟，弃上清（本步骤的目的是使细胞表面轻微固定，可防止固定后细胞粘连成团块。）

⑤再加入固定液5ml，将细胞悬浮并混匀，室温静置20～30分钟，然后1000r/min离心10分钟，弃上清。然后重复操作一次。最后加5ml固定液，将细胞悬浮并混匀，封上管口，置4℃过夜。

⑥取出离心管，1000r/min离心5分钟，轻轻吸去上清液，根据细胞压积多少而留下0.5～1ml固定液，将细胞悬浮并混匀后，吸取细胞悬液1～2滴，滴在刚从冰水中取出的载玻片上，用口吹散，并在火焰上通过数次，使细胞平铺于载玻片上，自然干燥。

⑦用新配制的10%Giemsa染液染色10～20分钟，然后用自来水洗去染液，自然干燥。（Giemsa染液配方：Giemsa粉0.5g，甘油33ml，55℃～60℃保温2小时，加甲醇33ml混匀，保存于棕色瓶内作为原液；取原液1份，加1/15mol/LpH6.8PBS9份，即成10%Giemsa染液）。

⑧镜检：选择染色体分散好，无重叠，无失散的细胞进行观察分析。每份标本应计数100个完整的中期核细胞，并注意观察是否有标志染色体。

（11-1-2）抗免疫球蛋白的类别和亚类鉴定

鉴定抗体的类和亚类有利于确定抗体的提纯方法。鉴定单抗Ig类和亚类的方法主要有两种，一种是免疫扩散，另一种是ELISA。

（11-1-2-1）免疫扩散法

该方法因其简便、准确而被经常应用。该法通常以杂交瘤细胞培养上清液作为被检的McAb样品，但因其单抗的浓度较低，所以应先将其浓缩10倍～20倍左右再检测。一般不用腹水型单抗作为被检样品，虽然小鼠腹水中的单抗浓度很高，但同时也含有小鼠本身的各类Ig，它们也会与相应抗血清发生反应，使鉴定结果出现混乱，即使将腹水稀释10倍～20倍后再检测也不能完全避免上述情况的发生。

材料：

①小鼠IgG及其亚类IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgM、IgA的抗血清。

②0.06mol/L巴比妥钠—盐酸缓冲液（pH8.6）。

③1%琼脂糖凝胶：1g琼脂糖加入100ml0.06moL/LpH8.6巴比妥钠—盐酸缓冲液中，煮沸溶解，加0.02%NaN₃防腐，4℃保存备用。

④洁净载玻片，打孔器（直径3mm），湿盒，酒精灯。

方法：

①杂交瘤细胞培养上清液的浓缩：

取该上清液10ml装入透析袋中，用线扎紧，放在小烧杯中，透析袋周围放置PEG6000或蔗糖或PVP（聚乙烯吡咯烷酮polyvinylpyrrolidone），放于4℃数小时，待透析袋内液体量浓缩至约0.5～1ml时，吸出，可于-20℃保存备用。也可采用吹风蒸发浓缩。

②加热溶化1%琼脂糖凝胶，铺制琼脂糖板，每片约3ml。

③待琼脂凝固后，用打孔器在琼脂板上打出梅花形的小孔（中央1孔，周围6孔），然后封底。

④向中央孔加入抗小鼠IgG类或亚类抗血清，周围孔加入待检样品；加样后将琼脂板放入湿盒，置37℃水浴中12～24小时或4℃过夜，观察结果。

（11-1-2-2）ELISA法

该法不需要将样品浓缩，而且比免疫扩散法更快得到结果。

材料：

①ELISA所用溶液同杂交瘤细胞的筛选。

②酶标板。

③山羊抗鼠Ig；兔抗小鼠Ig类及亚类特异性血清；HRP结合的山羊抗兔Ig等。

④待检杂交瘤细胞培养上清；阴性、阳性对照样品。

方法一：

①在酶标板每孔加入适量的100μl山羊抗小鼠Ig，室温放置2小时，洗涤液洗涤2次。

②向每孔中加200μl封闭液，室温作用1小时，洗涤液洗涤2次。

③再向孔中加100μl杂交瘤细胞培养上清，4℃过夜；同时设立阴性、阳性对照孔。

④洗涤4次后，每孔加100μl兔抗小鼠Ig类及亚类特异性抗血清，室温放置2小时。

⑤再洗涤4次后，加100μlHRP标记的山羊抗兔Ig，室温作用2小时。

⑥洗涤后，加底物显色，判定结果。

方法二：

①以适宜浓度的抗原包被酶标板，100μl/孔，4℃过夜。

②洗涤后，加入待检的单抗样品，100μl/孔，37℃1小时；同时设立阴性、阳性对照孔。

③洗涤后，加入HRP标记的抗小鼠类及亚类Ig的抗体试剂，100μl/孔，37℃避光显色15分钟；用2mol/LH₂SO₄终止反应后，阅读各孔的A490值。

（11-1-3）单抗纯度的鉴定

聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、SDS-PAGE、等电点聚焦电泳（IEF）及免疫转印分析（WB）等方法都可用于鉴定单抗的纯度。

（11-2）单抗理化特性的鉴定

单抗的理化特性鉴定包括单抗对温度、pH变化的敏感性以及单抗的亲和力鉴定，它们可为单抗的使用和保存提供重要依据。单抗亲和力的测定是十分重要的，它可为正确选择不同用途的单抗提供依据。

抗体亲和力是指抗体与抗原或半抗原结合的强度，其高低主要是由抗体和抗原分子的大小、抗体分子结合簇（部）和抗原决定簇之间的立体构型的合适程度决定的。

精确测定单抗的亲和力比较困难，在实际应用中通常只需测定各单抗的相对亲和力及其高低排列次序。常用的检测方法有：竞争性ELISA、非竞争性ELISA、间接ELISA、间接法夹心ELISA等。下面介绍竞争性ELISA测定单抗亲和常数的方法。其具体步骤如下：

①取适宜浓度的纯化抗原包被酶标板，100μl/孔，4℃过夜。

②洗涤后，加入封闭液（0.5%BSA-PBS，pH7.2）100μl/孔，37℃1小时。

③取一定浓度的单抗，与系列倍比稀释的抗原混合，4℃过夜，使反应达到平衡，所用抗原浓度至少要比抗体浓度高10倍以上。

④将平衡后的抗原抗体复合物加入酶标板孔中，100μl/孔，37℃1小时。

⑤洗涤后，加入适宜稀释度的HRP标记抗小鼠IgG抗体，100μl/孔，37℃1小时。

⑥洗涤后，加入底物（OPD）溶液，100μl/孔，37℃显色15分钟；2mol/LH₂SO₄终止反应后，于495nm波长测定各孔的吸收率（A）。按下列公式计算各单抗的亲和常数（K）：

A₀/（A₀-A）=K/a₀其中A₀=无抗原时A值；A=采用不同浓度抗原时的A值；a₀=抗原总量；K=亲和常数。

（12）单克隆抗体的标记

目前动物用单抗在很多方面有广泛的应用，大多以诊断试剂（盒）的形式提供，其中核心试剂为标记的单抗。下面将介绍最常用的几种标记技术。

（12-1）酶标记

（12-1-1）辣根过氧化物酶（HRP）标记

过碘酸钠法是辣根过氧化物酶（HRP）标记单抗和多克隆抗体的常用方法。其原理是：HRP的糖基用过碘酸钠氧化成醛基，加入抗体IgG后该醛基与IgG氨基结合，形成Schiff氏碱。为了防止HRP中糖的醛基与其自身蛋白氨基发生偶合，在用过碘酸钠氧化前先用二硝基氟苯阻断氨基。氧化反应最后，用硼氢化钠稳定Schiff氏碱。操作步骤如下：

程序一：

①将5mgHRP溶于500μl0.1mol/LNaHCO₃溶液中，加500μl10mmol/LNaIO₄溶液混匀，盖紧瓶塞，室温避光作用2小时。

②加750μl0.1mol/LNa₂CO₃混匀。

③加入750μl小鼠已处理的腹水，或纯化单抗等（15mg/ml），混匀。

④称取SephadexG25干粉0.3g，加入一支下口垫有玻璃棉的5ml注射器外筒内，随后将上述交联物移入注射器外套，盖紧，室温作用（避光）3小时（或4℃过夜）。

⑤用少许PBS将交联物全部洗出，收集洗出液，加1/20体积的新鲜配制的5mg/ml NaBH₄溶液，混匀，室温作用30分钟，再加入3/20体积的NaBH₄溶液，混匀，室温作用1h（或4℃过夜）。

⑥将交联物过SephadexG200或Sepharose6B（2.6cm×50cm）层析纯化，分管收集第一峰。

⑦酶结合物质量鉴定：

酶量（mg/ml）=OD₄₀₃×0.4

IgG量（mg/ml）=（OD₂₈₀-OD₄₀₃×0.3）×0.62

摩尔比值（E/P）=酶量×4/IgG量，一般在1～2。

酶结合率=酶量×体积/抗体。

标记率=OD₄₀₃/OD₂₈₀，标记率一般为0.3～0.6，OD₄₀₃/OD₂₈₀等于0.4时，E/P约为1。

酶活性和抗体活性的测定可应用ELISA法、免疫扩散、DAB-H₂O₂显色反应测定酶结合物的酶活性，抗体活性及效价、特异性。

⑧HRP抗体结合物的保存：加入等量甘油后，小量分装-20℃存放，防止反复冻融；或加入等量60%甘油4℃保存；不宜加NaN₃或酚防腐，否则会影响酶活性。必要时冻干保存，以BSA或脱脂牛奶作保护剂。

程序二：

①将5mgHRP溶于0.3mol/LpH8.1NaHCO₃溶液中，加入1%二硝基氟苯无水乙醇溶液100μL，室温搅拌作用1h，以封闭HRP分子上的α和ε氨基。

②再加1ml0.06mol/L过碘酸钠溶液，在室温中避光轻搅30分钟，溶液呈黄绿色，随后加1ml0.06mol/L乙二醇，轻搅1h，中止氧化反应。

③移入透析袋中，在1000ml0.01mol/LpH9.5碳酸盐缓冲液中，4℃透析过夜，更换三次缓冲液，注意避光。

④吸取上述醛化好的HRP溶液3ml，加入5mgIgG的碳酸盐缓冲液1ml，室温轻搅2～3小时，避光；加入5mgNaBH₄，4℃放置3小时或过夜，或换用乙醇胺（2mol/LpH9.5）0.2ml，作用7小时。

⑤再移入透析袋中，在0.02mol/LpH7.4PBS中透析24小时，更换三次缓冲液。

⑥3000r/min离心30分钟，除去沉淀物。上清液再用半饱和硫酸铵盐析三次，沉淀用少许PBS溶解，透析或层析除盐，必要时进一步层析纯化。

以下步骤同程序一。

（12-1-2）碱性磷酸酶（AP）标记

常用戊二醛一步法将碱性磷酸酶（AP）标记于抗体。将酶和单抗混合，再加入适量戊二醛，使酶和抗体蛋白的-NH2分别与两个醛基结合，制备成结合物。该法简便，但所得产物不均一，抗体活性损失大，酶标记率低。

其程序如下：

①将5mgAP加入1ml抗体溶液（2mg/ml）中溶解，装入透析袋，于4℃在0.01mol/L pH7.2PBS中透析18小时，换液三次。

②加入2.5%戊二醛20μl，室温作用1～2小时，4℃在PBS中透析过夜，其间换液三次。

③换用0.05mol/LpH8.0Tris-HCl缓冲液透析，4℃过夜，换液三次。

④取出标记抗体，用含1%BSA的Tris-HCl缓冲液稀释至4ml，即为AP标记物原液。

⑤每毫升中加入0.4ml甘油，小量分装，保存备用。

（12-2）荧光素标记

（12-2-1）异硫氰酸荧光素（FITC）标记

FITC是最常用的荧光素，其次选用TRITC（四甲基异硫氰酸罗丹明）。FITC和TRITC是常用的双标记组合。FITC标记抗体的原理是在碱性条件下，FITC的异硫氰基能与IgG的自由氨基结合，形成IgG与荧光素的结合物。

其标记步骤如下：

①以碳酸盐缓冲液（pH9.3，Na₂CO₃8.6g，NaHCO₃17.3g，蒸馏水1000ml）调整抗体浓度至10mg/ml。

②取5ml抗体溶液置于10ml小烧杯中。

③称取1mgFITC溶于0.2mlDMSO中，待溶解后立即缓慢滴加于抗体溶液中，边加边轻搅，然后室温避光作用2小时。

④将交联物经SephadexG25或G50柱层析除去游离的荧光素，分管收集第一峰为标记的抗体。

⑤FITC的结合物质量鉴定

IgG量（mg/ml）=（OD₂₈₀-OD₄₉₅×0.35）/1.4

F/P=2.87×OD₄₉₅/（OD₂₈₀-OD₄₉₅×0.35）。

一般情况下，FITC对抗体的摩尔比为3∶1时适合于组织切片染色，为5～6∶1时适合于细胞悬液染色。以标记抗体染色各种抗原，测定其特异性染色滴度和非特异染色的程度。

⑥标记抗体的保存：宜保存于4℃，加NaN₃防腐。

（12-3）同位素标记

在使用同位素标记单抗或其他蛋白之前，应掌握同位素操作和防护知识。正常情况下应避免物理接触、有效保护γ-射线照射，使用同位素标记抗体时，应利用防护装置，并合理处置含放射性的废料。

（12-3-1）碘标记

用碘标记抗体是一种有效的标记方法。125I衰变产生低能的γ和Χ射线，很容易被检测出来，而其60天的半衰期保证足够的有效使用期，且能很方便地处理放射废料。

最常用的碘标记方法是氯胺T法，即将氧化剂氯胺T加入到抗体和碘化物的溶液中，Na¹²⁵I在氯胺T作用下I转化成I₂，游离I₂可与抗体分子中酪氨酸和一些组氨酸发生卤化反应，用还原剂和游离酪氨酸终止反应，经凝胶过滤将标记的抗体与碘化酪氨酸及还原剂分离开。

其主要操作步骤如下：

①在进行标记之前，先选用截流分子量为20000～50000的凝胶，制备1ml凝胶柱，然后分别用10倍体积的1%BSA/PBS/0.02%叠氮钠和PBS洗涤柱体，封住柱下口，备用。

②加入10μg纯化单抗至含有25μl2.5mol/L磷酸钠（pH7.5）的1.5ml指形管内，随后加入500uCiNa¹²⁵I混匀。

③加入25μl新配制的2mg/ml氯胺T，室温放置60秒。再加入50μl氯胺T终止液（含2.4mg/ml偏重亚硫酸钠，10mg/ml酪氨酸，10%甘油和0.1%环乙烷酰二甲苯的PBS）。

④将上述碘标记物上样在凝胶柱表面，小心放开柱体下口，用1.5ml指形管收集。

⑤当碘标记物全部进入柱体，加入0.3ml含0.03%NaN₃的PBS，用另一指形管收集0.3ml，然后再加0.3ml0.03%NaN₃PBS，下口收集0.3ml，重复进行，同时用同位素检测仪测定标记与未标记的单抗。标记抗体大约在第二至第四管出现。无害化处理柱子和非单抗标记部分。

⑥将标记单抗保存于4℃可使用6周时间。

（12-3-2）生物合成法标记

将杂交瘤细胞培养在含有放射性前体的培养基中，随着抗体分子的合成、组装，同位素会标记在抗体分子的初级氨基酸链上，本方法不会导致抗体活性的丧失。其主要步骤是：

①离心收集处于对数生长期的杂交瘤细胞，约需2×10⁶个细胞。以预热37℃不含甲硫氨酸的培养基洗涤上述细胞。

②用含2%PBS不含甲硫氨酸的培养基悬浮杂交瘤细胞至每毫升10⁶，加入35S甲硫氨酸。

③经CO₂培养箱中培养过夜，离心后吸出培养上清，分别加入1/20体积的1mol/LTris（pH8.0）及叠氮钠至浓度0.02%。该标记抗体可按纯化单抗方法进行。

(12-4）生物素标记

生物素标记反应常用生物素琥珀酰亚胺酯进行。生物素是与抗体分子的游离赖氨酸等发生偶联反应而完成标记。

其主要步骤是：

①用DMSO配制10mg/ml的N-羟琥珀酰亚胺生物素（应根据需要选用不同大小和间臂长的生物素化琥珀酰酯）。

②用硼酸钠缓冲液（0.1mol/L，pH8.0）稀释单抗溶液至1～3mg/ml。

③每毫克抗体加入25～250μg的生物素酯，混匀后，室温作用4小时。

④按每250μg生物素酯加入20μl1mol/LNH₄Cl终止反应，室温放置10分钟。

⑤以PBS充分透析除去游离生物素，标记抗体冻存。