糖化酶制备及活力测定-生物技术制药实验

2023-12-07 百科知识版权反馈

【摘要】：实验八糖化酶的制备及酶活力测定一、糖化酶的制备1.实验目的掌握糖化酶摇瓶实验的基本操作。显微镜观察菌丝形状，测量发酵液pH，测定糖化酶活力。葡萄糖分子中含有醛基，能被次碘酸钠氧化，过量的次碘酸钠酸化后析出碘，再用硫代硫酸钠标准溶液滴定，由此可计算酶活力。

实验八　糖化酶的制备及酶活力测定

一、糖化酶的制备

1.实验目的

掌握糖化酶摇瓶实验的基本操作。

2.实验原理

摇瓶培养是实验室常用的通风培养方法，通过将装有液体培养物的三角瓶放在摇床上振荡培养，以满足生物生长、繁殖及产生代谢产物对氧的需求。

3.实验材料

（1）菌种黑曲霉（Aspergillusniger)。

（2）培养基玉米粉12g，豆饼粉4g，麸皮2g，水200ml。

（3）器材500ml三角瓶、载玻片、摇床等。

4.实验步骤

（1）配制培养基

玉米粉6%，豆饼粉2%，麸皮1%，补足水分，原料浸入水中。8层纱布加牛皮纸包扎，0.1MPa下灭菌30分钟。分装于500ml三角瓶中，装液量分别为100ml、200ml。

（2）接种

成熟斜面，在无菌条件下，注入10ml无菌水，振荡成孢子悬浮液。待发酵培养基灭菌后冷却到30℃～32℃时，分别将孢子悬浮液接入三角瓶中，接种量为2ml，做好标记。

（3）培养

将三角瓶固定在摇床上，培养温度为31℃，转速为200rpm/min，培养时间为96小时。

（4）显微镜观察菌丝形状，测量发酵液pH，测定糖化酶活力。

5.实验结果

比较两种不同装液量条件下的菌体形状特征、酶活力。

二、糖化酶活力测定

1.实验目的

掌握糖化酶活力测定的原理与方法。

2.实验原理

糖化酶能从淀粉分子非还原性末端开始分解α-1，4糖苷键生成葡萄糖。葡萄糖分子中含有醛基，能被次碘酸钠氧化，过量的次碘酸钠酸化后析出碘，再用硫代硫酸钠标准溶液滴定，由此可计算酶活力。

碘量法原理为在碱性介质（NaOH）中，碘歧化为次碘酸钠和碘酸化钠，次碘酸钠氧化溶液中游离的醛基为羧基，适当酸化。剩余的次碘酸钠与碘化钠又生成碘，以淀粉为指示剂，用硫代硫酸钠标准溶液滴定。根据总碘量和硫代硫酸钠的用量，可对应获得甲醛的量。反应为：

I₂+2OH-=OI^-+I^-+H₂O

HCHO+OI-+OH^-=HCOO^-+I^-+H₂O(www.chuimin.cn)

OI^-+I-+2H⁺=I₂+H₂O

I₂+2S₂O₃²-=S₄O₆²-+2I^-

3.实验材料

（1）溶液及试剂

乙酸—乙酸钠缓冲溶液，硫代硫酸钠标准溶液，碘溶液，氢氧化钠溶液，硫酸溶液，20g/L可溶性淀粉溶液，10g/L淀粉指示剂。

（2）器材

恒温水浴锅、滴定管架、碱式滴定管、秒表、比色管、碘量瓶、容量瓶等。

4.实验步骤

（1）酶与底物反应

取4支试管，按下表加入相应溶液和试剂，使酶与底物发生反应。

表3-4　试剂表

（2）测定

吸取上述1、2、3管的反应液及4号空白对照管的空白液各5ml，分别置于碘量瓶中，准确加入碘溶液10ml，再加0.1mol/L氢氧化钠溶液15ml，摇匀，密塞，暗处反应15分钟后取出，加入2mol/L硫酸溶液2ml，摇匀，立即用0.05mol/L硫代硫酸钠标准溶液滴定至浅黄色，再加入1ml10g/L淀粉指示液，继续滴定直至蓝色刚好消失为其终点。

5.结果分析

酶活力单位x=（A-B）×C×n×579.9

（1）空白对照消耗的硫代硫酸钠标准溶液的体积（ml）。

（2）样品消耗的硫代硫酸钠标准溶液的体积（ml）。

（3）硫代硫酸钠标准溶液的浓度（mol/ml）。

（4）稀释倍数。

6.注意事项

（1）糖化酶活力受温度影响较大，糖化时温度一定要严格控制。

（2）一定要同时做空白实验，以校正糖化酶本身与可溶性淀粉中的还原物质。

（3）滴定时要准确，注意反应颜色的瞬时性。

7.思考题

（1）为什么要设立空白管做对照？