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SOD提取、分离与活性测定-生物技术制药实验结果

2023-12-07 百科知识版权反馈

【摘要】：实验五SOD的提取、分离及活性测定1.实验目的了解酶类药物的特性和功能，掌握提取、分离超氧化物歧化酶的基本原理和过程。大蒜蒜瓣和悬浮培养的大蒜细胞中含有较丰富的SOD，通过组织或细胞破碎后，可用pH7.8的磷酸缓冲液提取。将上述提取液、粗酶液和酶液分别取样，测定各自的SOD活力。

实验五　SOD的提取、分离及活性测定

1.实验目的

了解酶类药物的特性和功能，掌握提取、分离超氧化物歧化酶（SOD）的基本原理和过程。

2.实验原理

超氧化物歧化酶（SOD）是一种重要的氧自由基清除剂，具有抗衰老、抗氧化、抗辐射和消炎等作用，作为药用酶在美国、德国、澳大利亚等国已有广泛应用。目前临床上的应用主要集中在自身免疫性疾病上，如类风湿关节炎，红斑性狼疮，皮肌炎等。SOD可催化超氧负离子（O₂^-）进行歧化反应，生成氧和过氧化氢：2O₂^-＋H₂＝O₂＋H₂O₂。大蒜蒜瓣和悬浮培养的大蒜细胞中含有较丰富的SOD，通过组织或细胞破碎后，可用pH7.8的磷酸缓冲液提取。由于SOD不溶于丙酮，可用丙酮将其沉淀析出。

3.实验试剂与器材

（1）市售新鲜蒜瓣。

（2）通过细胞培养技术获得的大蒜细胞。

（3）磷酸缓冲液：0.05mol/L，pH7.8。

（4）氯仿—乙醇混合溶剂：氯仿∶无水乙醇=3∶5。

（5）丙酮：用前冷却至4℃～10℃。

（6）碳酸盐缓冲液：0.05mol/L，pH10.2。

（7）EDTA溶液：0.lmol/L。

（8）pH8.20.05MTris-Hcl缓冲液

储存液（0.2MTris溶液)：Tris24.228g加纯水至100ml。

应用液：250ml0.2MTris溶液加0.1N盐酸225ml，再加纯水至100ml。（9）1mM邻苯三酚溶液

储存液（0.1M)：1.2611gAR级邻苯三酚加纯水至100ml。应用液：1ml储存液加10mlHC1至100ml。

（10）紫外分光光度计、酸度计、水浴锅、离心机、秒表及常规分析仪器等。4.操作步骤

（1）组织或细胞破碎

将大蒜蒜瓣或大蒜细胞于研磨器中研磨，使组织或细胞破碎。

（2）SOD的提取

在上述破碎的组织或细胞中加入2倍～3倍体积的0.05mol/LpH7.8的磷酸缓冲液，继续研磨搅拌20分钟，使SOD充分溶解到缓冲液中，然后5000r/min，离心15分钟，弃沉淀，得提取液。(www.chuimin.cn)

（3）除杂蛋白

在上述提取液中加入0.25倍体积的氯仿—乙醇混合溶剂，搅拌15分钟，5000r/min离心15分钟，去杂蛋白沉淀，得粗酶液。

（4）SOD的沉淀分离

在上述粗酶液中加入等体积的冷丙酮，搅拌15分钟，5000r/min离心15分钟，得SOD沉淀。再将SOD沉淀溶于0.05mol/LpH7.8的磷酸缓冲液中，于55℃～60℃热处理15分钟，离心弃沉淀，得到SOD酶液。

（5）将上述提取液、粗酶液和酶液分别取样，测定各自的SOD活力。

①取4.5mlpH8.2Tris-HC1缓冲液加4.1ml纯水，于25℃恒温水浴放置20分钟，加0.1ml纯水及1mM邻苯三酚0.3ml，混匀，于紫外分光光度计325nm波长处迅速测其自氧化速率，每隔30秒测一次，5分钟内测完，记录吸光度，得出邻苯三酚自氧化速率A值。

②4.5mlpH8.2Tris-HC1缓冲注液加4.1ml纯水，于25℃恒温水浴放置20分钟，加0.1mlSOD酶液及1mM邻苯三酚0.3ml，混匀，迅速测其吸光度，每隔30秒测一次，5分钟内测完，计算得加SOD后邻苯三酚的自氧化速率B值。

③活力计算

在一定条件下，每分钟抑制邻苯三酚在325nm波长处自氧化速率达50%所需酶量定义为一个酶活力单位。

SOD总活力单位＝SOD活性·SOD液体积SOD活性（u/ml）

A——邻苯三酚自氧化速度

B——加SOD后，邻苯三酚自氧化速度

V——反应液体积（9ml）

N——样品稀释倍数

V1——酶提取液体积（0.1ml）

样品中SOD活性（u/ml）

5.结果分析

计算出大蒜样品中SOD的活力。

6.思考题

（1）SOD提取过程中哪些因素影响提取物有效成分的活性？如何减轻酶类药物制备过程中不良因素的影响？