重组尿激酶效价测定实验

2023-12-07 百科知识版权反馈

【摘要】：实验四重组尿激酶的效价测定尿激酶是一种分子量为54KDa的高度糖基化丝氨酸蛋白酶，初分泌时是无活性的单链，在其Lys－Ile处切开，则成为由二硫键连接的具有活性的双链尿激酶，即20 KDa的A链和34KDa的B链。重组尿激酶是将带有尿激酶基因的重组质粒转化大肠杆菌，高效表达尿激酶，经高度纯化后加入适量人血白蛋白稳定剂冻干制成。重组尿激酶活性的测定常见下面两种方法。尿激酶是丝氨酸蛋白酶，丝氨酸和组氨酸是其活性中心的必需氨基酸。

实验四　重组尿激酶的效价测定

尿激酶是一种分子量为54KDa的高度糖基化丝氨酸蛋白酶，初分泌时是无活性的单链，在其Lys（158）－Ile（159）处切开，则成为由二硫键连接的具有活性的双链尿激酶，即20 KDa的A链和34KDa的B链。B链为丝氨酸蛋白酶裂解区，是该酶的活性中心。尿激酶一种有效的溶血栓药，临床上多用于急性心肌梗死、脑梗死、心绞痛和肺栓塞的治疗，用药越早，溶栓效果越好。

重组尿激酶是将带有尿激酶基因的重组质粒转化大肠杆菌，高效表达尿激酶，经高度纯化后加入适量人血白蛋白稳定剂冻干制成。重组尿激酶活性的测定常见下面两种方法。

一、纤维蛋白平板法

1.实验目的

掌握纤维蛋白平板法测定尿激酶活性的方法。

2.实验原理

凝血酶可催化纤维蛋白原的裂解，水解它们的N末端多肽，生成纤维蛋白。尿激酶是丝氨酸蛋白酶，丝氨酸和组氨酸是其活性中心的必需氨基酸。尿激酶的专一性很强，它可以直接作用于无活性的纤溶酶原的Arg－Val键使之成为有活性的纤溶酶，纤溶酶可降解纤维蛋白，使血凝块水解。

在纤维蛋白一琼脂平板中加入待测尿激酶样品，尿激酶激活平板中的纤溶酶原使之成为纤溶酶，纤溶酶将平板中纤维蛋白降解而出现透明的溶解圈，测量溶解圈直径的大小即可计算尿激酶活性的大小。

3.实验试剂及材料

（1）琼脂糖

（2）生理盐水

（3）人凝血酶用生理盐水配成100U/ml，分装，于-20℃保存。

（4）纤溶酶原用生理盐水配成0.5mg/ml，分装，于-20℃保存。

（5）人纤维蛋白原实验前配制，配制前人纤维蛋白原和备用的生理盐水均在37℃水浴预热15分钟，然后用适量生理盐水溶解，37℃水浴静置保温30分钟使其完全溶解，配制成6mg/ml溶液待用。

（6）尿激酶标准品用生理盐水稀释成以下5个稀释度（U/ml）：1000、500、250、125、62.5。

（7）尿激酶样品用生理盐水稀释为2个不同浓度的样品。

（8）直径8cm的平皿、直径2mm的玻璃硬管、100ml三角烧瓶、刻度直尺

4.实验仪器

水浴锅、电炉、冰箱

5.实验步骤

（1）纤维蛋白平板的制备

称取125mg琼脂糖，加入23ml生理盐水，煮沸溶解，60℃水浴平衡，加入人凝血酶14μl（100U/ml），纤溶酶原280μl（0.5mg/ml），边加边摇匀，然后加2.2ml人纤维蛋白原（6mg/ml），不停地摇动，待浑浊后立即倒平皿（直径8cm），水平放置，充分凝固后于4℃放置至少30分钟待用（应在两天之内使用）。

（2）打孔及点样

在形成的纤维蛋白平皿内打孔，直径为2mm，每孔点样10μl，每个待检测样品和标准品各点两个孔，在37℃湿盒中水平放置24小时。

6.结果分析

纵横量取溶解圈直径各两次，以4次量取的溶解圈直径的平均值的对数为纵坐标（y），以尿激酶标准品各个稀释度的活性对数（x）为横坐标，按生物统计学方法分析结果，并求得y＝a＋bx中的a和b，根据待测尿激酶样品的溶解圈直径可求得待测样品的活性。

7.注意事项

（1）制备纤维蛋白平板的过程中，在加入凝血酶、纤溶酶原和纤维蛋白原后一定要不停地摇匀。

（2）打孔要尽量间隔均匀。

（3）测定溶解圈直径时一定要纵横两次量取。(www.chuimin.cn)

图3-3　纤维蛋白平板打孔示意图

图3-4　纤维蛋白平板溶解圈图例

二、发色底物法

1.实验目的

掌握发色底物法测定尿激酶活性的方法。

2.实验原理

尿激酶是丝氨酸蛋白酶，丝氨酸和组氨酸是其活性中心的必需氨基酸。尿激酶可使无活性的纤溶酶原成为有活性的纤溶酶，纤溶酶可切开一些三肽发色底物〔如：S2251（D-Val-Leu-Lys-p-NitroanilideDihydrochloride）〕的肽链，产生游离发色基团——对硝基苯胺（pNA），从而使溶液显色，溶液颜色深浅与pNA浓度成正比，pNA在405nm处有强吸收峰，吸光度值大小可反映出尿激酶活性大小。

3.实验试剂及材料

（1）TritonX-100

（2）人纤溶酶原

（3）纤溶酶发色底物S2251（D-Val-Leu-Lys-p-Nitroanilide Dihydrochloride）

（4）Tris缓冲液浓度为50mmol/L，pH8.1，其中含0.1%TritonX-100

（5）尿激酶标准品用生理盐水稀释成以下6个稀释度（U/mL）：6000、3000、1500、750、375。

（6）尿激酶样品用生理盐水稀释为2个不同浓度的样品。

（7）50%醋酸溶液

（8）96孔培养板、200μl、20μlTip

4.实验仪器

酶标仪、微量移液器、37℃培养箱。

5.实验步骤