《生物技术制药实验》-青霉素效价测定成果

2023-12-07 百科知识版权反馈

【摘要】：实验三青霉素效价的测定1.实验目的了解用杯碟法测定抗生素效价的原理，掌握青霉素效价生物测定的具体操作步骤与方法。本实验采用国际上最常用的杯碟扩散法来测定青霉素的效价。

实验三　青霉素效价的测定

1.实验目的

了解用杯碟法测定抗生素效价的原理，掌握青霉素效价生物测定的具体操作步骤与方法。

2.实验原理

抗生素的效价测定法有：液体稀释法、比浊法和扩散法等。本实验采用国际上最常用的杯碟扩散法来测定青霉素的效价。将规格完全一致的牛津小杯（即不锈钢小管）置于含敏感菌的琼脂平板上，在牛津小杯中加入已知浓度的标准青霉素溶液和未知浓度的青霉素发酵液，抗生素会自牛津小杯处向平板四周扩散，在抑菌浓度所达范围内敏感菌的生长被抑制而出现抑菌圈。在一定的范围内，抗生素浓度的对数值与抑菌圈直径呈线性关系。因此，只要将被测样品与标准品的抑菌圈直径进行比较，就可在标准曲线上查得未知样品的抗生素效价值。

3.实验试剂及材料

（1）0.2mol/L磷酸缓冲液（pH=6）：K₂HPO₄0.2g（或K₂HPO₄·3H₂O0.253g），KH₂PO4 0.8g，蒸馏水100ml。

（2）0.85%Nacl生理盐水溶液。

（3）苄青霉素钠盐：1.667U/mg（1U即1国际单位，等于0.6μg）。

（4）菌种：金黄色葡萄球菌（Staphylococcus），产黄青霉（Penicilliumchrysogenum）。

（5）培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，作生物测定时，平板分上下两层，上层需另加0.5%葡萄糖。

（6）牛津小杯[内径（6+0.1）mm，外径（8+0.1）mm，高（10+0.1）mm]，培养皿（直径90mm，深20mm；大小一致，皿底平坦），滴管、移液管等。

4.实验步骤

（1）制备敏感菌悬液

①传代与保存：将测定用的金黄色葡萄球菌在新鲜斜面培养基上传代，每隔3周传代一次，在37℃恒温箱内培养18～20小时后，再于室温下放置3～4小时，使菌种斜面产生良好的色素，然后将其置于4℃冰箱保存。

②活化：使用前先将供试菌株在斜面培养基上连续传代3~4次，使菌种充分恢复其生理性状。

③制备悬液：将活化的敏感菌斜面，用0.85%生理盐水洗下，经离心后去除上清液，再用生理盐水洗涤1～2次，最后将其稀释至一定浓度的悬液。

（2）配制青霉素标准溶液

①青霉素标准母液配制：准确称取纯苄青霉素钠盐15～20mg，在一定量的0.2mol/L磷酸缓冲液（pH=6）中溶解，使其成2000U/ml的青霉素溶液，冷藏存放。

②青霉素标准工作液配制：以标准母液配成10U/ml青霉素标准工作液。按下表加入10U/ml青霉素标准工作液，即配成不同浓度的青霉素标准工作液。

表3-1　不同浓度标准青霉素液的配法

（3）绘制标准曲线

①铺底层培养基：取无菌培养皿15套，每皿移入20ml牛肉膏蛋白胨底层琼脂培养基，水平放置，待凝备用。

②铺含菌上层培养基：融化三角瓶中的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（100ml），待冷却到60℃左右时加入60%葡萄糖液12ml和金黄色葡萄球菌菌液3～5ml（加入菌液的浓度应控制在使1U/ml青霉素溶液的抑制菌圈直径在20～24mm），充分混匀后，吸取4ml迅速铺于底层平板上层，水平放置，待凝备用。

③放牛津小杯：待上层充分凝固后，在每个琼脂板上轻轻放置4支牛津小杯，其间距应相等，如图所示：

④滴加标准样品液：用无菌移液管或带滴头的滴管滴加标准样品液，每一稀释度应更换一支移液管或滴管，每支牛津小杯中的加量为0.2ml，每一稀释度做3个重复。加液量如下图所示，与杯口水平为准。

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图3-1　牛津小杯放置示意图

图3-2　液量示意图

⑤培养：加完样品后，最好换上无菌素烧瓷盖做培养皿的盖子，其吸湿性好，在盖内不易形成水滴，然后将平板置37℃恒温箱内培养18～24小时。

⑥测量与计算：先移去测定培养皿的素烧瓷盖，再移去牛津小杯，精确测量各稀释度的青霉素的抑制圈直径（用圆规两脚的针尖测量可提高精度）。计算方法：

a.算出各组（即各剂量）及各组1U/ml抑制圈的平均直径。

b.统计15套培养皿中1U/ml的抑制圈平均值。c.以1U/ml抑制圈的总平均值来校正各组的1U/ml抑制圈的平均值，即求得各组的校正值。d.以各组1U/ml的抑制圈的校正值校正各剂量单位浓度的抑制圈直径，即获得各组抑制圈的校正值。

举例：若30个1U/ml青霉素溶液的抑制圈直径的平均值为22.6mm，而第一组内6个1U/ml青霉素溶液的抑制圈直径的平均值为22.4mm，则：第一组的校正值=22.6-22.4=+0.20（mm）。若第一组皿内0.4U/ml青霉素溶液的抑制圈平均值为18.6mm，那么第一组0.4U/ml青霉素溶液的抑制圈校正值=18.6+0.2=18.8（mm）。其他各组依次类推获得各自的校正值。

⑦绘制标准曲线：在对数坐标纸上，以青霉素浓度（对数值）为纵坐标，以抑制圈直径的校正值为横坐标，绘制标准曲线。

（4）测定青霉素发酵液的效价

①在无菌培养皿内铺底层及含菌上层培养基，方法同上。

②待平板充分凝固后，每套含菌测定平板上均匀地放置4支牛津小杯，小杯中心坐落在培养皿两互相垂直直径的各自半径的中心。

③用摇瓶或发酵罐接种、培养青霉素高产分泌菌株——产黄青霉，用0.2mol/LpH6.0磷酸盐缓冲液对青霉素发酵液作适当稀释，每个被检验样品用3套培养皿测定其效价。

④在牛津小杯中加样品液，青霉素标准液（1U/ml）与发酵液的稀释液间隔地加入牛津小杯中，加液量务求准确，以降低操作误差。

⑤加完样品的平板放37℃下培养18～24小时后。

（5）青霉素发酵液效价的计算

①求校正值：将1U/ml青霉素标准测定液在培养皿中抑菌圈的平均值与曲线上1U/ml抑菌圈直径相互比较，以求得其校正值。

②校正发酵液的值：用此校正值校正被检发酵液抑菌圈直径，以求得发酵液的近似效价值。

③查对标准曲线值：用此校正值在标准曲线上查得被检青霉素发酵液（稀释液）的效价单位。

④发酵原液的效价：将上述效价值乘上其稀释倍数，即可求得青霉素发酵液原液的效价值。