生物技术制药实验：2-DE分析鉴定蛋白质成果

2023-12-07 百科知识版权反馈

【摘要】：实验十二二维双向凝胶电泳分析鉴定蛋白质双向凝胶电泳是目前蛋白质组研究中最有效的分析鉴定技术之一。第二向SDS-PAGE有垂直板电泳和水平超薄胶电泳两种做法，可分离10～100kD分子量的蛋白质。

实验十二　二维双向凝胶电泳（2-DE)分析鉴定蛋白质

双向凝胶电泳是目前蛋白质组研究中最有效的分析鉴定技术之一。分离蛋白质组所有蛋白的两个关键参数是其分辨率和可重复性。在目前情况下，双向凝胶电泳的一块胶板（16cm×20cm）可分离出3～4千个、甚至1万个可检测的蛋白斑点，但这与10万个基因可表达的蛋白数目相比还是太少了。因此，20世纪80年代开始采用固定化pH梯度胶，其克服了载体两性电解质阴极漂移等许多缺点，从而建立了非常稳定的可以随意精确设定的pH梯度。由于可以建立很窄的pH范围（如0.05U/cm)，所以对特定的区域可在较窄的pH范围内做第二轮分析，从而大大提高了分辨率。此种胶条已有商品生产，因此基本上解决了双向凝胶电泳的重复性问题。第二向SDS-PAGE有垂直板电泳和水平超薄胶电泳两种做法，可分离10～100kD分子量的蛋白质。

1.实验目的

理解并掌握蛋白质的双向凝胶电泳分析技术。

2.实验原理

双向凝胶电泳的原理是第一向基于蛋白质的等电点不同采用等电聚焦分离，第二向则按分子量的不同用SDS-PAGE分离，从而把复杂的蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开。

3.操作步骤

（1）样品制备

蛋白质的溶解、变性、还原及去除非蛋白质杂质。

（2）IPG胶制备

利用不同pK的固定化电解质可配置不同pH范围的凝胶或利用商业化软件设计。可制备不同pH分离范围的IPG干胶条，如宽范围胶条，可分离pH3～10，pH3～12；窄范围胶条，可分离pH4～7，pH6～11，pH5～8，甚至可以限定到一个pH单位。

（3）第一相等电聚焦电泳

目前，第一相等电聚焦大多采用Amersham pharmacia Biotech公司的IPGphor或Bio-Rad公司的仪器。通常采用的胶条厚度为0.5mm，宽3mm；pH范围通常有3～10、4～7、6～11几类，上样量可达毫克级。(www.chuimin.cn)