蛋白质类药物的分离与纯化：生物技术制药实验

2023-12-07 百科知识版权反馈

【摘要】：实验十蛋白质类药物的分离、纯化1.实验目的理解凝胶过滤层析法分离、纯化物质的基本原理。理论上凝胶过滤不涉及蛋白质与凝胶之间的吸附或排斥作用。凝胶过滤柱是由均匀装填的多孔凝胶微粒组成，不同蛋白质通过这些微孔的迁移能力不同，从而使蛋白质被分离。

实验十　蛋白质类药物的分离、纯化

1.实验目的

（1）理解凝胶过滤层析法分离、纯化物质的基本原理。

（2）掌握凝胶过滤层析的基本工艺流程。

2.实验原理

凝胶过滤层析，也称为分子筛层析，是一种根据蛋白质类物质分子的大小和形状来进行分离的方法。理论上凝胶过滤不涉及蛋白质与凝胶之间的吸附或排斥作用。凝胶过滤柱是由均匀装填的多孔凝胶微粒组成，不同蛋白质通过这些微孔的迁移能力不同，从而使蛋白质被分离。

如果蛋白质分子的大小超过凝胶微孔的大小，在通过层析柱时它就会在凝胶颗粒外面绕行而不是从颗粒内穿行。如果蛋白质分子小于凝胶微孔，这些蛋白质分子就会不受阻碍地在凝胶颗粒内穿行，因此，大分子蛋白质将比小分子蛋白质更迅速地迁移通过凝胶过滤柱。

图2-6　凝胶色谱分离原理示意图

3.实验试剂与器材

0.05MNaAC-HAC缓冲液，ddH₂O，SephacrylS-300HR凝胶，吸管，柱色谱分离装置，eppendorf管，淀粉酶工程菌株。

图2-7　柱色谱分离装置(www.chuimin.cn)

4.操作步骤

（1）将SephacrylS-300HR凝胶用0.05MNaAC-HAC缓冲液平衡后，装柱。

（2）以0.05MNaAC-HAC缓冲液过柱1小时，流速为2ml/min，充分平衡层析柱。

（3）将浓缩的淀粉酶工程菌发酵上清液样品上样。

（4）用0.05MNaAC-HAC缓冲液洗脱。

（5）收集各洗脱蜂样品，收集速率为10s/tube。

（6）将各组样品于4℃保存，待检测。

（7）层析柱再平衡。

5.思考题

（1）凝胶色谱和其他类型色谱的差异在哪里？

（2）凝胶色谱分离出的物质流出的先后顺序与其分子量大小之间的关系如何？