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2023-12-07
红曲霉色素制备实验-生物技术制药实验七
【摘要】：实验七红曲霉摇瓶发酵制备红曲霉色素1.实验目的通过红曲霉红曲色素的发酵制取过程，掌握菌种制备、培养基制备、发酵过程控制、发酵中间参数测定等微生物发酵的基本流程和技术。研究表明，产红曲色素的红曲霉代表菌株有3种，其中以紫红曲霉的红曲色素产量最高。b.红曲色素标准溶液制备准确称量1mg红曲色素标准品，用乙醇定容至10ml，于4℃低温保存。制备含填充剂红曲色素、离心、喷雾干燥成品，计算色素回收率。
实验七 红曲霉摇瓶发酵制备红曲霉色素
1.实验目的
通过红曲霉红曲色素的发酵制取过程，掌握菌种制备、培养基制备、发酵过程控制、发酵中间参数测定等微生物发酵的基本流程和技术。
2.实验原理
人工培养的微生物，通过体内的特定酶系，经过复杂的生物化学反应过程和代谢作用，最终合成人们所需要的药物如抗生素、氨基酸、有机物、维生素等。七十年代初，人们开始对红曲霉进行更深入研究。近来研究发现，红曲中含有降脂药物——羟甲基戊二醛辅酶A（HMG－COA）还原酶抑制剂，且国内已有以红曲为主要成分的新药“血脂康”和“地奥脂必妥”等上市。研究表明，产红曲色素的红曲霉代表菌株有3种，其中以紫红曲霉的红曲色素产量最高。
3.发酵工艺流程
原始斜面菌种→斜面接种培养（28℃、7天）→茄子瓶培养（28℃、7天）→摇瓶培养（28℃、48小时）→测定色价、pH、还原糖、总糖，观察菌丝形态（次/8小时）→发酵液高压均质、添加填充剂→离心喷雾干燥。
4．实验步骤
（1）试管斜面培养基配制及接种
①斜面培养基制备：可溶性淀粉3%，蔗糖6%，蛋白胨2%，琼脂3%，pH6.0。
a.先在预定液量一半以上的水中，依次加入培养基成分，溶解（此时可加温或搅拌)。经常使用且添加量少的成分可预先配制成50倍～1000倍的浓溶液，使用时用移液管定量添加浓溶液即可。有些物质在溶液状态容易分解，可在冷暗处保藏。
b.调节pH6.0：通常用1～2mol/L氢氧化钠或盐酸调pH，本实验采用乳酸溶液。除特殊情况外，应在预定液量一半以上的溶液中调节pH，调整pH后，再加水到预定体积。
c.在培养基为液态时注入试管，普通试管装液量为7～8ml，塞上棉塞之后，121℃灭菌30分钟，趁其呈溶解状况如图2-3所示倾斜试管固化。在所有操作中要注意不使棉塞沾染上培养基。分装时沾在容器口壁附近的培养基，通常会是以后污染的原因，所以要特别注意（尤其是固体培养基）。
图2-3 斜面培养基固化方式
②接种：菌种为红曲霉As.3.782。
左手取原始斜面菌种与待接种斜面各一支，原始斜面菌种位于左上，于无菌操作台中用接种环按下图接种，置培养箱28℃、培养7天。定时观察形态，做好记录。
图2-4 斜面接种时试管的两种拿法
1～2接种环的灭菌3.拔出试管棉塞4.转移菌种
图2-5 斜面接种无菌操作程序
（2）茄子瓶斜面菌种培养及形态观察
a.茄子瓶斜面培养基配制同试管斜面培养基。
b.接种基本同试管斜面接种，用接种铲铲五块菌块均布于茄子瓶中，置培养箱28℃、培养7天。定时观察形态，做好记录。
（3）摇瓶培养基制备、接种及摇瓶发酵培养
a.摇瓶培养基配制：玉米粉5%，豆饼粉2%，MgSO4·7H2O1.5%，K2HPO4·3H2O0.1%，121℃灭菌30分钟，冷却至室温备用。摇瓶培养基装量：250ml/500ml。培养基灭菌的同时灭菌吸管和配制无菌水。
b.在无菌操作台中，将10～15ml无菌水注入茄子瓶中，用接种环来回刮数次，然后将菌种悬液倒入培养基已灭菌的摇瓶中，28℃，选择合适转速培养48小时。(www.chuimin.cn)
（4）形态观察
于无菌环境中取10ml左右摇瓶发酵液，观察菌丝形态（次/每8小时），测定色价、pH、还原糖、总糖。
（5）红曲色素色价、色素成分测定
①发酵液总色素含量的测定：
发酵液色价测定：取0.2～1ml发酵液用70%乙醇定容至100ml，超声提取20分钟，在505nm下测吸光度，以70%乙醇作空白，使吸光度值在0.2～0.8。发酵液的色价（u/ml）=测得的吸光度值×稀释倍数。
发酵液总色素量=发酵液的色价×发酵液的体积
②色素成分测定：
红曲中色素的含量高、种类多（6～8种），不同来源的红曲中红、橙、黄色素的量也不同，且固态发酵得到的产物中还含有大量的其他代谢产物。因干扰物太多，所以一般的薄层层析法很难分辨出红曲中的色素，因此宜采用双向薄层层析法来分析红曲中的色素成分。
a.制板
硅胶加水调成糊状，均匀铺在玻璃板上，自然干燥后于105℃活化1小时，放于干燥器中待用。
b.红曲色素标准溶液制备
准确称量1mg红曲色素标准品，用乙醇定容至10ml，于4℃低温保存。
c.待测样制备
红曲样品经70%乙醇浸泡，超声波提取20分钟，离心，取上清液，低温保存，备用。
d.点样
用微量注射器按需要量将标准品和待测样品分别点在适当位置，一般点样量不超过10μl，样圈直径不超过5mm。
e.展开
将展开剂按比例混合加入层析缸，展开剂的量以淹没薄层8~10mm为宜。第一相展开结束后，取出薄层放置一段时间，使展开剂自然挥发，进行第二相展开。f.紫外检测将展开后的薄板，挥发至干，于紫外灯下进行观察。
（6）制备含填充剂红曲色素、离心、喷雾干燥成品，计算色素回收率。
a.每9组合并发酵液（1～2L），用均质机均质后加入20%可溶性淀粉，混悬后待离心喷雾干燥。
b.调整好离心喷雾干燥机工作状态后，喷雾干燥，得干粉并计重。
c.测干粉色价，计算色素回收率。
5.注意事项
注意无菌操作。
6.思考题
（1）色素成分分析为什么采用双向薄层层析法？
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2023-12-07
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