重组质粒转染人PBMC细胞实验结果

2023-12-07 百科知识版权反馈

【摘要】：实验四重组质粒转染人PBMC细胞1.实验目的了解脂质体转染的原理，掌握脂质体转染的基本技术。加入IL-2，1.1μl/ml，以维持PBMC细胞生长。48小时后，将培养的人PBMC细胞悬液转移至10ml离心管中，离心使细胞沉淀。

实验四　重组质粒转染人PBMC细胞

1.实验目的

了解脂质体转染的原理，掌握脂质体转染的基本技术。

2.实验原理

转染是指将克隆获得的外源基因导入哺乳动物细胞的技术。转染技术通常分为生化方法转染和物理方法转染。生化方法转染包括脂质体转染、磷酸钙介导的转染、DEAE（二乙基氨基）－葡聚糖介导转染等，物理方法转染包括电穿孔及生物粒子作用。

脂质体是由磷脂双层构成的具有水相内核的脂质微囊，作为一种可供选择的基因载体，脂质体具有无毒、无免疫原性、可生物降解的特点。由于脂质体具有磷脂双层结构，与细胞膜结构类似，因此可与受体细胞膜融合。阳离子脂质体与DNA混合后将形成一种稳定的复合物，这种复合物可直接加在培养细胞中，然后黏附于细胞表面，通过与细胞膜融合，将外源基因释放到胞浆中。

3.实验试剂及材料

两瓶人PBMC细胞（1×10⁶个/ml），重组质粒（PCDNA3.1-TCRVβ7.1或其他），RPMI-1640培养基、胎牛血清、白介素2溶液（IL-2）、青霉素、链霉素，转染试剂TransMaster，无菌NaCl溶液（150mmol/L），12孔细胞培养板，10ml灭菌离心管，灭菌玻璃滴管，灭菌枪头（1000μl、200μl和10μl），无菌转染用塑料管。

4.实验步骤

（1）将培养的人PBMC细胞悬液转移至10ml离心管中，2000rpm，离心10分钟使细胞沉淀，弃上清，加入1ml无血清RPMI-1640培养液重悬细胞。

（2）调节PBMC细胞浓度

应用细胞计数板在显微镜下计数细胞，计算细胞浓度，用无血清的RPMI-1640培养液调节细胞数至5×10⁵个/ml，滴管吹打均匀。(www.chuimin.cn)

（3）接种PBMC细胞

将调好浓度的细胞悬液加入12孔培养板中，每孔2ml，6孔用于转染，6孔作为对照。

（4）吸取重组质粒pCDNA3.1-TCRVβ7.112μg于1.5mlEP管中，加入无菌NaCl溶液至终体积为300μl，轻轻混匀。

（5）吸取24μl基因转染试剂TransMaster于转染管中，加入无菌NaCl溶液至终体积为300μl，混匀，室温孵育10分钟。

（6）将第5步制得的脂质体溶液加入第4步的质粒溶液中，轻轻混匀，室温孵育25分钟。

（7）将第6步制得的TransMaster/DNA混合溶液加至接种有PBMC细胞的12孔培养板中，100μl/孔。

（8）加入IL-2，1.1μl/ml，以维持PBMC细胞生长。将培养板放入二氧化碳培养箱，培养3小时后换新鲜培养基，同时向孔板内各孔加入胎牛血清，使培养液中含有10%的胎牛血清，维持细胞正常生长，继续培养。

（9）48小时后，将培养的人PBMC细胞悬液转移至10ml离心管中，离心使细胞沉淀（2000rpm，10分钟）。加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液，重悬细胞。继续培养至检测其他指标。