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2023-12-07
质粒大规模制备实验结果
【摘要】：实验三质粒的大规模制备1.实验目的掌握质粒大规模制备的原理及基本流程。大肠杆菌重组质粒的提取纯化工艺主要建立在常规碱法制备和柱层析分离纯化的基础上。经过上述碱裂解法制备的质粒DNA，还含有大量杂蛋白、内毒素及部分基因组DNA、RNA，因此在大规模制备时，一般采用柱层析方法进行分离纯化。同时也应防止DNase引起DNA的降解。
实验三 质粒的大规模制备
1.实验目的
掌握质粒大规模制备的原理及基本流程。
2.实验原理
在非病毒类载体的重组DNA药物研发及生产中，质粒的大规模制备是核心技术。大肠杆菌重组质粒的提取纯化工艺主要建立在常规碱法制备和柱层析分离纯化的基础上。在EDTA存在的条件下，经NaOH和阴离子去污剂SDS处理，细胞膜崩解，菌体充分裂解，细菌染色体DNA缠绕附着在细胞膜碎片上，经离心，染色体DNA被沉淀出来，而质粒DNA则留在上清液中，经有机溶剂沉淀，则可获得质粒DNA。
经过上述碱裂解法制备的质粒DNA，还含有大量杂蛋白、内毒素及部分基因组DNA、RNA，因此在大规模制备时，一般采用柱层析方法进行分离纯化。离子交换层析法纯化质粒的原理主要是利用各种大分子物质的电荷差异，在适当pH条件下，质粒DNA与大部分杂蛋白都带负电荷，质粒DNA所带负电荷一般多于杂蛋白，并且质粒DNA电荷数目与基因组DNA、RNA等也存在一定的差异，因此可通过离子交换层析将其分开。
3.实验试剂
（1）LB培养基。
（2）卡那霉素储液（50mg/ml，双蒸水溶解，-20℃保存）。
（3）RNA酶（10mg/ml，-20℃保存）。
（4）碱裂解溶液Ⅰ〔高压灭菌，50mmol/L葡萄糖、25mmol/LTris-Cl（pH8.0）、10mmol/L EDTA（pH8.0）〕。
（5）碱裂解溶液Ⅱ〔（高压灭菌，0.2mol/LNaOH、1%（m/V）SDS〕。
（6）碱裂解溶液Ⅲ（高压灭菌，5mol/L醋酸钾60.0ml、冰醋酸11.5ml、H2O8.5ml）。
（7）TE缓冲液〔10mmol/LTris-Cl（pH8.0)、1mmol/LEDTA（pH8.0）〕。
（8）分别含0.02mol/L、0.3mol/L、1.0mol/LNaCl的TE溶液。
（9）0.5mol/LNaOH。
（10）50×TAE〔每升溶液中含：242gTris碱、57.1ml冰乙酸、100ml0.5mol/LEDTA（pH8.0）〕。
（11）10×上样缓冲液。
（12）STE〔高压灭菌，10mmol/LTris-Cl（pH8.0）、0.1mol/LNaCl、1mmol/LEDTA（pH8.0）〕。
4.实验仪器
恒温水浴、恒温培养箱、恒温振荡器、高速冷冻离心机、常压层析系统、超净工作台、电泳仪、水平电泳装置、紫外检测仪。
5.实验步骤
（1）培养细菌使质粒扩增
取200μl菌种接种于200mlLB培养基[临用前按1∶1000倍体积加入卡那霉素溶液(50mg/ml)]中，37℃，220rpm，培养过夜。
（2）碱裂解法大量提取质粒DNA
①将扩增培养的菌液在4℃，5000g条件下离心5分钟，弃上清。(www.chuimin.cn)
②将细菌沉淀重悬于5ml洗涤液STE中，4℃，5000g，离心5分钟，去掉STE，使细菌沉淀尽可能干燥。
③加入5ml预冷的碱裂解溶液Ⅰ重悬沉淀。
④加入10ml新鲜配制的碱裂解溶液Ⅱ，快速颠倒离心管5次，使离心管的整个内表面均与溶液Ⅱ接触，以混合内容物，然后静置5分钟。
⑤再加入7.5ml预冷的碱裂解溶液Ⅲ，温和振荡10秒使溶液Ⅲ在黏稠的细菌裂解物中分散均匀，然后将离心管置冰上5分钟。
⑥4℃，12000g，离心15分钟，取上清。
⑦加0.6倍体积的异丙醇，冰上放置15分钟后，在常温条件下，12000g，离心20分钟，弃上清。
⑧再加10ml70%乙醇，12000g离心10分钟，弃上清，在空气中干燥沉淀。
（3）离子交换层析法纯化并鉴定质粒DNA
①用TE（8ml，含20μg/ml的RNaseA）溶解沉淀，在37℃保温2小时后取出1ml用于纯度鉴定，将余液再用TE稀释至50ml。
②用30mlTE洗柱，再用30ml含0.02mol/lNaCl的TE溶液平衡DEAE层析柱，然后上样。未特别说明，流速均为1.5ml/min。
③用含0.02mol/lNaCl的TE溶液洗柱至基线平衡，再用含0.3mol/LNaCl的TE溶液洗柱至基线平衡（去处杂蛋白及其他小分子物质），最后用含1mol/LNaCl的TE溶液洗柱至基线平衡（洗脱质粒DNA），在洗脱过程中收集各吸收峰。
④用0.8%琼脂糖电泳检测各洗脱峰，确定质粒所在洗脱峰。
⑤测定所得质粒在260nm、280nm处吸收值，计算浓度和纯度。
6.注意事项
（1）实验菌种生长的好坏直接影响质粒DNA的提取，对存放时间较长的菌种需要事先加以活化。
（2）细菌培养过程要求无菌操作。抗生素等不能高温灭菌，应使用细菌滤器过滤后使用。细菌培养液、配试剂用的蒸馏水、离心管等有关用具需经高压灭菌处理。
（3）制备质粒的过程中，所有操作必须温和，不能剧烈振荡，以避免机械剪切力对DNA的断裂作用。同时也应防止DNase引起DNA的降解。
（4）提取过程尽量在低温条件下进行（冰浴上）。
（5）离子交换层析纯化质粒时，应从离子强度的角度考虑柱平衡。
7.思考题
（1）碱裂解法提取质粒的过程中，EDTA、NaOH、SDS、醋酸钾等试剂的作用是什么？
（2）试分析柱层析过程中，不同离子强度洗脱时洗脱组分的组成成分。
（3）采用紫外光吸收法测定样品的核酸含量，有何优点及缺点？
（4）琼脂糖电泳进行鉴定质粒DNA时，多数情况下能看到三条带，这三条带是什么？
（5）碱裂解法抽提得到的质粒样品含线性DNA吗？
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2023-07-02
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