胰蛋白酶的亲和色谱实验结果

2023-12-07 百科知识版权反馈

【摘要】：实验四十二胰蛋白酶的亲和色谱1.实验目的掌握采用亲和色谱法分离和纯化胰蛋白酶2.实验原理亲和色谱主要是根据生物分子与其特定的固定化的配基或配体之间具有一定的亲和力而使生物大分子得以分离。②将亲和色谱获得的胰蛋白酶溶液放入透析袋内，在4℃对蒸馏水透析，然后冷冻干燥成干粉。

实验四十二胰蛋白酶的亲和色谱

1.实验目的

掌握采用亲和色谱法分离和纯化胰蛋白酶

2.实验原理

亲和色谱主要是根据生物分子与其特定的固定化的配基或配体之间具有一定的亲和力而使生物大分子得以分离。本实验为了纯化胰蛋白酶，采用胰蛋白酶的天然抑制剂——鸡卵黏蛋白作为配基制成亲和吸附剂，从胰脏粗提取液中纯化胰蛋白酶，鸡卵黏蛋白是专一性较高的胰蛋白酶抑制剂，对牛和猪的胰蛋白酶具有相当强的抑制作用，但不抑制糜蛋白酶。在pH7～8的缓冲液中，鸡卵黏蛋白可与胰蛋白酶牢固地结合；而在pH2～3时，又能被解离下来。

因此，采用鸡卵黏蛋白制成的亲和吸附剂可以从胰脏粗提取液中通过一次亲和色谱直接获得活力大于10000U/mg的胰蛋白酶制品，比用经典分离纯化方法简便得多，纯化效率还可达到10倍～20倍以上。

3.实验材料与试剂

溴化氰活化的琼脂糖凝胶4B，卵类黏蛋白，1mmol/L盐酸，碳酸氢钠缓冲液〔含0.05mmol/LNaCl的0.1mol/L（pH8.3）NaHCO₃缓冲液，此为偶联的缓冲液〕，乙酸缓冲液〔含0.05mol/LNaCl的0.1mol/L（pH4）的乙酸缓冲液〕，0.1mol/L（pH5.0）Tris-HCL缓冲液（含0.5mol/L氯化钾和0.05mol/L氯化钙，此为平衡缓冲液），粗胰蛋白酶，硫酸铵，0.01mol/L盐酸，0.8mol/L（pH9.0）硼酸盐缓冲液，0.10mol/L（pH2.5）甲酸-0.50mol/LKCL洗脱液。

4.实验仪器与器材

电磁搅拌器，色谱柱（2cm×12cm），紫外分光光度计，分布收集器，过滤漏斗。

5.实验步骤

（1）偶联凝胶的处理

称取偶联凝胶10g，用200ml1mol/L的盐酸浸泡15分钟，然后再过滤漏斗中，用1mol/L盐酸洗涤几次。每克偶联凝胶的体积溶胀3.5ml左右。然后用50ml碳酸氢钠缓冲液洗涤，立刻转到配基溶液中进行偶联。

（2）配基的偶联

取3g卵类黏蛋白（含蛋白1.7g左右）用30ml偶联缓冲液溶解，加入处理好的凝胶，预冷至4℃，搅拌16小时，以使剩余的活化基团完全消除。然后用过滤漏斗抽滤，用偶联缓冲液洗涤一次，再用0.1mol/L（pH=4）的乙酸缓冲液洗涤，以除去剩余的配基（卵类黏蛋白）。所得的亲和吸附剂，每毫升偶联凝胶含蛋白质10mg左右，预存在4℃冰箱中备用。

（3）装柱

取一层柱，先装入1/4体积的平衡缓冲液。然后轻轻搅匀，将偶联好的卵类蛋白Sephadax亲和吸附剂缓缓加入柱内，待其自然沉降，调好流速3ml/min左右，用亲和柱平衡液平衡，检测流出液OD280小于0.02。

（4）上样

将1g左右粗结晶猪胰蛋白酶（蛋白含量50%~60%）溶于少量平衡缓冲液中（若有不溶物应离心除去），然后上柱，流速控制在1.0~1.5ml/min。上柱完毕之后，用相同的平衡缓冲液洗涤亲和色柱谱，直至流出液的OD260小于0.02。取一定体积上述澄清液上柱吸附。上柱体积可大致计算如下：

胰蛋白酶上样体积（ml）

式中V——卵黏蛋白偶联的总体积；

0.84——1㎎卵黏蛋白能抑制约0.84mg胰蛋白酶；

1.3×10⁴——纯化后胰蛋白酶比活的近似值；(www.chuimin.cn)

c——胰蛋白酶粗提液的浓度，mg/ml；

A——胰蛋白酶粗提液的比活，U/mg；

1.5——上样量过量50%。

（5）洗脱

吸附完毕，先用平衡液洗涤，至流出液OD280小于0.02，换洗脱液洗涤。洗脱液为0.10mol/L（pH2.5）甲酸-0.50mol/LKCL溶液。洗脱速度2～4ml/10min，然后收集蛋白蜂，并测定收集液的蛋白含量，酶的比活力和总活力。

（6）再生

亲和色谱柱用平衡缓冲液平衡和可再次做亲和色谱。若在柱内加入防腐剂0.01%叠氮钠在冰箱中至少可存放一年其活性仍可保持。

（7）成品的保存

可用两种方法将胰蛋白酶制成固体保存。①在比活力最高部分加入固体硫酸铵，使其饱和度达到80%，放置4h以上，抽滤收集硫酸铵沉淀（要抽干）。滤饼用少量蒸馏水溶解，再加入1/4体积0.8mol/L（pH9.0）的硼酸溶液，调整pH8.0，冰箱中放置，数日后即可获得棒状结晶（只有胰蛋白酶的量较多时，才能得到结晶）。②将亲和色谱获得的胰蛋白酶溶液放入透析袋内，在4℃对蒸馏水透析，然后冷冻干燥成干粉。

6.注意事项

（1）在偶联凝胶处理时，一定要保证时间，使凝胶能处理完全。

（2）装柱过程中一定要注意，将偶联好的卵类蛋白Sephadax亲和吸附剂缓缓加入柱内，待其自然沉降，不能速度过快，否则将在柱内引入空气使凝胶内产生气泡，影响分离效果。

7.思考题

（1）绘制亲和柱色谱洗脱曲线

（2）计算鸡卵黏蛋白的比活力

（3）绘制酶促反应动力曲线（求初速度）

（4）计算亲和色谱纯化胰蛋白酶的比活力及纯化效率

（5）将亲和色谱过程中的各项数据详细列入下表:

表1-24　参数表