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2023-12-07
酵母蔗糖酶活力测定与动力学研究
【摘要】：实验四十酵母蔗糖酶活力测定及酶促动力学研究1.实验目的掌握酵母蔗糖酶活力测定方法及其原理掌握酵母蔗糖酶的酶促动力学研究方法2.实验原理酶促动力学研究酶促反应的速度及影响速度的各种因素，而米氏常数Km值等于酶促反应速度为最大速度一般时所对应的底物浓度，其值大小与酶的浓度无关，是酶促反应的特征常数。各种试剂的加样量也应准确，并严格控制酶促反应时间。
1.实验目的
（1）掌握酵母蔗糖酶活力测定方法及其原理
（2）掌握酵母蔗糖酶的酶促动力学研究方法
2.实验原理
酶促动力学研究酶促反应的速度及影响速度的各种因素，而米氏常数Km值等于酶促反应速度为最大速度一般时所对应的底物浓度，其值大小与酶的浓度无关，是酶促反应的特征常数。不同酶的Km值不同，同一种酶与不同的底物反应时，其Km值也不同，Km值反映了酶和底物亲和力的强弱程度，Km值越大，表明酶和底物的亲和力越弱；Km值越小，表明酶与底物的亲和力越强。
酶的活力就是酶所催活的反应速度，通常用单位时间内底物的减少或产物的增加来表示。酶反应过程中产物的生成和时间的关系可以用进程曲线来说明，曲线的斜率就是酶反应过程中的反应速度。从进程曲线来看，在一定时间内反应速度维持恒定，但随着时间的延长，反应速度逐渐降低，这是由多种因素造成的。所以，为了准确表示酶的反应速度必须采用初速度，即保持恒定时的速度。同样，不同酶浓度下的反应进程曲线也可以说明这个问题。酶活力可以被某些物质改变，凡能降低酶的活力甚至使酶失活的物质，均称为抑制剂，其中又有可逆抑制和不可逆抑制两种类型。而可逆抑制又包括竞争性抑制、非竞争性抑制等类型。在有抑制剂存在的条件下，酶的一些动力学性质会发生改变，如Km,Vmax等，可通过作图法求得，作图法很多，最常用的就是Lineweaver-Burk作图法（即双倒数作图法）。
3.实验仪器和试剂
恒温水浴锅，电炉，722分光光度计，0.2mol/L乙酸缓冲液，0.5mol/L蔗糖溶液，8mol/L脲。
4.实验步骤
（1）时间作用曲线
取试管编号，按下列顺序加入各种试剂，待测酶样用组分4，其稀释倍数以酶活力测定时的数据为准。
表1-21 试剂表
表1-22
(www.chuimin.cn)
以还原糖的量（μmol）为纵坐标，时间为横坐标作时间作用曲线。
（2）底物浓度的影响
表1-23
取试管编号，按下表加样。
计算个试管中的蔗糖浓度和反应速率V（单位：），用反应速率对底物浓度作图，再用1/V对1/S作图，计算Km和Vmax。
（3）脲对蔗糖酶的抑制
取试管编号，按下表加各种试剂。
以反应速率对底物浓度作图，再用1/V对1/S作图，计算出表观Km、Vmax、Ki，说明其抑制类型。
5.注意事项
（1）研究酶的活力应以酶促反应的初速度为准。
（2）本实验采用的是一种定量测定方法，为获得准确的实验结果，应尽量减少实验操作带来的误差。因此，在配置各种底物浓度时，应用同一母液进行稀释，以保证底物浓度的准确性。各种试剂的加样量也应准确，并严格控制酶促反应时间。
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