酵母蔗糖酶纯化与测定-生物技术制药实验

2023-12-07 百科知识版权反馈

【摘要】：实验三十九酵母蔗糖酶的部分纯化与纯度测定一、酶的纯化1.实验目的掌握酵母蔗糖酶的部分纯化与纯度测定方法及原理。洗脱至混合器中液体流完为止，测定各接收管在280nm下的光吸收值，并用尿糖试纸进行半定量测定各管的酶活力，将最高酶活力的1管酶液作为第四组分用于纯度测定。尿糖试纸是固定化酶应用于临床检测糖尿病的实例。

实验三十九酵母蔗糖酶的部分纯化与纯度测定

一、酶的纯化

1.实验目的

（1）掌握酵母蔗糖酶的部分纯化与纯度测定方法及原理。

（2）掌握酵母蔗糖酶的纯度测定方法及原理。

2.实验原理

酵母中含有丰富的蔗糖酶（EC.3.2.1.26），本实验以酵母为原料，通过破碎细胞、热处理、乙醇沉淀、离子交换柱层析等步骤，提取蔗糖酶，并用聚丙烯酰胺凝胶电泳对其纯度进行测定。

离子交换层析法（ion-exchange chromatogramphy,简称IEC）中常用的阳离子交换剂有弱酸性的羧甲基纤维素（CM-纤维素），阴离子交换剂有弱碱性的二乙氨基乙基纤维素（DEAE-纤维素）。蛋白质的混合物与纤维素离子交换剂的酸性基团或碱性基团相结合，结合力的大小取决于彼此之间相反电荷基团的静电引力，这又与溶液的pH值有关，因为pH值决定离子交换剂和蛋白质的解离程度。盐类的存在可以降低离子交换剂的解离基团与蛋白质的相反电荷之间的静电引力，因此被的蛋白质的洗脱可通过改变pH值或离子强度（或两者同时改变）来实现。与离子交换剂结合力小的蛋白质首先从层析柱中被洗脱下来。梯度洗脱是在洗脱过程中，使洗脱液的pH值（或两者同时）发生连续的变化，从而使吸附在柱上的各组分在不同的梯度下被洗脱下来。

3.实验材料、仪器和试剂

（1）材料干酵母。

（2）仪器

高速离心机，恒温水浴锅，层析柱（1.0cm×16cm），梯度混合器，部分收集器。

（3）试剂

①95%乙醇溶液。

②DEAE-SepharoseFastFlow。

③1mol/L醋酸溶液。

④0.05mol/LTris-HCl缓冲液（pH7.3）。

⑤0.05mol/LTris-HCl缓冲液（内含1mol/LNaCl溶液）pH7.3。

4.实验步骤

（1）破碎细胞

取15g干酵母，加5~10g石英砂，置于预先冷却的研钵中，加30ml去离子水，研磨30分钟，在冰箱中冰冻约20~30分钟（研磨液面上刚出现冰结为宜），重复2次，加5ml去离子水，置离心管中，12000r/min离心15分钟，留0.5ml上清液为第一组分。

（2）加热除杂蛋白将上清液倒入三角瓶，将1mol/L醋酸溶液逐滴加入，调其pH值至5.0，然后迅速放入到50℃的水浴中，保温30分钟。在温育过程中，注意经常缓慢摇动试管或搅拌抽提液。之后在冰浴中迅速冷却之，以12000r/min的转速离心20分钟，取0.5ml上清液为第二组分。弃去沉淀。

（3）乙醇沉淀

量出上清液的体积，并加入等体积的95%冷乙醇溶液（预先放在-20℃低温下的时间不少于30分钟），于冰浴中温和搅拌20分钟。然后以12000r/min的转速离心25分钟，小心弃去上清液，沉淀沥干。将沉淀溶解在6ml0.05mol/LTris-HCl缓冲液（pH7.3）中，搅拌（5分钟以上）使其完全溶解，以12000r/min的转速离心25分钟，取出0.5ml上清液作为第三组分，剩余部分（乙醇抽提液）进行第4步骤操作。

（4）上柱

装DEAE-SepharoseFastFlow离子交换柱层析，用0.05mol/LTris-HCl缓冲液(pH7.3)平衡。将乙醇抽提液上柱，上样后用0.05mol/LTris-HCl缓冲液(pH7.3)平衡，然后用0.05mol/L Tris-HCl缓冲液(内含1mol/LNaCl溶液)pH7.3进行NaCl梯度(NaCl溶液浓度为0~1mol/L)洗脱，层析柱连上线性梯度混合器，混合器分别装30ml0.05mol/LTris-HCl缓冲液(pH7.3)和30ml含有100mmol/LNaCl的0.08mol/LTris-HCl缓冲液(pH7.3)，每1分钟收集1管。洗脱至混合器中液体流完为止，测定各接收管在280nm下的光吸收值，并用尿糖试纸进行半定量测定各管的酶活力，将最高酶活力的1管酶液作为第四组分用于纯度测定。

用尿糖试纸进行半定量测定：

在点滴板中滴3滴待测酶液，再加3滴含5%蔗糖的pH4.6的醋酸缓冲液，搅匀，37℃放置20分钟，浸入尿糖试纸，1秒后取出，60秒钟比较颜色的深浅，与比色卡对照。

尿糖试纸的原理：

尿糖试纸是首先将葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶和无色的化合物固定在纸条上，制成能够测试尿糖含量的酶试纸。溶液（或尿液）中的葡萄糖在葡萄糖氧化酶的催化作用下，可形成葡萄糖酸和过氧化氢，过氧化氢在过氧化氢酶的催化作用下又可生成水和原子氧。原子氧可将某种无色的化合物氧化成有色的化合物。当这种酶试纸与溶液（或尿液）相遇时，很快就会因溶液（或尿液）中葡萄糖含量由少到多而依次呈现出浅蓝、浅绿、棕或深棕色。尿糖试纸是固定化酶应用于临床检测糖尿病的实例。

5.结果分析

以梯度洗脱出的管数为横坐标，以吸光度A280、酶活力为纵坐标，绘出层析曲线和酶活曲线图。

6.注意事项

梯度洗脱装置中的贮液瓶和混合瓶两者容量应相等，且置于同一水平位置。混合瓶用来盛装起始洗脱液，贮液瓶装高浓度洗脱液。洗脱前先开动搅拌器，后开启连接两瓶的活塞，这样可使混合瓶中的洗脱液呈直线式递增。

二、圆盘电泳测定纯度

1.实验原理

聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacryamide gel electrophoresis，简称PAGE)又根据其有无浓缩效应分为连续的和不连续的两种。前者是指电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下主要具有电荷及分子筛效应；后者电泳体系中由于缓冲液离子成分、pH值、凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中的泳动不仅有电荷效应和分子筛效应，还具有浓缩效应。下面就这3种物理效应分别加以说明。

（1）电荷效应：各种样品分子按其所带电荷的种类及数量，在电场作用下以一定速度向一定电极泳动。

（2）分子筛效应：相对分子质量或分子大小和形状不同的样品分子，通过一定孔径分离胶时，因受到阻碍程度的不同而表现出不同的迁移率，这就是分子筛效应。相对分子质量小、形状为球形的分子在电泳过程中受到的阻力较小，移动较快；反之，那些相对分子质量大、形状不规则的分子在电泳过程中受到的阻力较大，移动较慢。这种效应与凝胶过程中的情况不同。(www.chuimin.cn)

（3）浓缩效应：待分离样品中的各组分在浓缩胶中会被压缩成层，而使原来很稀的样品得到高度浓缩。其原因如下：

①由于两层凝胶孔径不同，样品向下移动到两层凝胶接口时，阻力突然加大，速度变慢，这样就在两层凝胶交界处使待分离的样品区变窄，浓度升高。

②在聚丙烯酰胺凝胶中，虽然浓缩胶和分离胶用的都是Tris-HCl缓冲液，但上层浓缩胶的pH值为6.7，下层分离胶的pH值为8.9。HCI是强电解质，不管在哪层胶中，HCl几乎都发生电解，Cl^-布满整个胶体。待分离的样品加在顶部，浸在pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液中。电泳一开始，有效泳动率最大的Cl^-迅速跑到最前边，成为快离子（前导离子)。在pH6.7的条件下，解离度仅有0.1%～1%的甘氨酸有效泳动率最低，跑在最后面，成为慢离子（尾随离子)。这样，快离子和慢离子之间就形成了一个不断移动的接口。在pH值6.7的条件下，带有负电荷的样品其有效泳动率介于快、慢离子之间，被夹持分布于接口附近，逐渐形成一个区带。

由于快离子快速向前移动，在其原来停留的那部分地区成了低离子浓度区及低电导区。因为电位梯度U、电流I和电导率k之间有如下关系：

U=I/k

所以，在电流恒定条件下，低电导区两侧就产生了较高的电位梯度。这种在电泳开始后产生的高电位梯度作用于样品和甘氨酸慢离子，使其加速前进，追赶快离子。本来夹在快、慢离子之间的样品区带，在这个追赶中被逐渐地压缩聚集成一条更为狭窄的区带。这就是所谓的浓缩效应。在此区带中，各种样品分子又按其电荷而分成不同层次，在进入分离胶前被初步分离，形成若干条分离得很近但又不同的“起跑线”。后来，当样品分子和慢离子都进入分离胶后，pH值从6.7变为8.9，甘氨酸解离度剧增，其有效迁移率迅速加大到超过所有样品分子，此时，快、慢离子的接口跑到被分离的样品分子之前，不连续的高电位梯度不再存在。于是，在此后的电泳过程中，样品在一个均一的电位梯度和pH值条件下，仅按电荷效应和分子筛效应而被分离。与连续系统相比，不连续系统的分离条带清晰度及分辨率大大提高，因此已成为目前广泛使用的分离分析手段。

2.实验仪器和试剂

（1）仪器

稳流稳压电泳仪，垂直式圆盘电泳槽，微量加样器，长针头注射器。

（2）试剂

①凝胶贮存液（A液)：聚丙烯酰胺32g、甲叉双丙烯酰胺1.0g，加水使其溶解后定容至100ml，过滤除去不溶物，置棕色瓶中，于4℃下贮存。

②凝胶缓冲液（pH值8.9)（B液)：取24ml1mol/LHCl溶液、18.15gTris、0.25mlTEMED，加水定容至100ml。

③0.2%过硫酸铵溶液（C液)：取0.2g过硫酸铵加水溶解，定容至100ml。现配现用。

④上极电极缓冲液：取6.32gTris、3.94gGly，加水溶解，定容至100ml，使用时稀释10倍。

⑤下极电极缓冲液：取12.1gTris、50mL1mol/LHCl溶液，加水溶解，定容至100ml，使用时稀释10倍。

⑥溴酚蓝-甘油溶液：取5ml50%甘油溶液、5ml上极电极缓冲液、5ml1%溴酚蓝溶液混匀。

⑦12.5%三氯乙酸溶液。

⑧染色液：取0.25g考马斯亮蓝R250、90.8ml50%甲醇溶液、9.2ml冰乙酸混匀。

⑨脱色液：取7.5ml乙酸溶液、5ml甲醇溶液。加水87.5ml混匀。

3.操作步骤

（1）凝胶柱的制备

将A液、B液按1∶1的比例混合于烧杯中，另取2倍体积C液于另一烧杯中，有条件的可将它们一同放在真空干燥器里减压抽气，以排除溶液中的气泡。每组准备好用封口膜封底的4支玻璃管后，取A液2.5ml，B液2.5ml，C液5ml置烧杯中，轻轻混匀，用移液管沿玻璃管壁小心向每支玻璃管中加2ml混合液，用手指轻弹管壁，以将管中胶液可能含有的气泡赶出，然后用滴管在胶液面上小心注入蒸馏水至管顶，以防胶液凝结时表面形成弯月面并隔绝空气。当水层与胶液交界处出现一清晰界面时，表明胶已聚合完成。

（2）样品的制备

取第一组分50μl，加10μl样品缓冲液（溴酚蓝-甘油缓冲液）。

取第二组分50μl，加10μl样品缓冲液（溴酚蓝-甘油缓冲液）。

取第三组分80μl，加20μl样品缓冲液（溴酚蓝-甘油缓冲液）。

取第四组分250μl，加50μl样品缓冲液（溴酚蓝-甘油缓冲液）。

混合后供电泳分析用。

（3）加样和电泳

聚合后,从玻璃上小心去掉封口膜，用滤纸吸干凝胶上层的水，把凝胶管插入到圆盘电泳槽的槽洞橡皮塞中，上、下槽分别加入约600ml的上、下极电极缓冲液，使玻璃管上、下端及上、下电极均浸没在缓冲液中，并使两端管口都不存在气泡。然后用滴管或微量进样器分别往凝胶管表面加入第一、二、三、四组分样品液。上槽接负极，下槽接正极，以每管2mA的电流强度电泳30分钟后，电流强度加大到每管4mA，当指示剂溴酚蓝带移至凝胶柱下端约1cm处时，停止电泳。

（4）脱胶、染色及脱色

把从电泳槽中取出的凝胶管用带长针头的注射器脱胶。将吸满水的注射针头沿壁插入到玻璃管壁与凝胶之间，边注水边推进针头，并缓慢放置玻璃管，使凝胶与管壁分离，则胶柱自然滑出，若不能滑出可用吸耳球吹出。将脱出的凝胶放在盛有固定液的试管中固定30分钟，再转入染色液中染色30分钟，然后用脱色液浸泡至蛋白区带清晰为止。

4.结果分析

观察并记录实验结果，判断酶的纯度，画出圆盘电泳酶纯度的检验结果。

5.注意事项

（1）注胶前应检查准备好的玻璃管是否有漏。

（2）加满胶液的玻璃管应尽量放直静置，以使凝结后的胶面平整并与管壁垂直。

（3）脱胶时注意勿使针头损伤凝胶柱而妨碍观察谱带。

酵母蔗糖酶纯化与测定-生物技术制药实验

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