酶的固定化方法及原理-木瓜蛋白酶实验

2023-12-07 百科知识版权反馈

【摘要】：实验三十八酶的固定化一、木瓜蛋白酶的固定化1.实验目的掌握酶的固定化方法和原理。本实验中的尼龙固定化木瓜蛋白酶属共价键结合法。本试验选用海藻酸钠对木聚糖酶进行包埋固定。

实验三十八酶的固定化

一、木瓜蛋白酶的固定化

1.实验目的

（1）掌握酶的固定化方法和原理。

（2）掌握固定化酶酶学性质的研究方法。

2.实验原理

通过物理或化学的方法处理，使酶变成不易随水流失即运动受到限制，而又能发挥催化作用的酶制剂。制备过程是将水溶性的酶与水不溶性载体结合，使酶固定在载体上。固定化酶的特性主要表现在：

（1）可以在较长时间内多次使用，而且在多数情况下，酶的稳定性提高。

（2）反应后，酶与底物和产物易于分开，产物中无残留酶，易于纯化，产品质量高。

（3）反应条件易于控制，可实现转化反应的连续化和自动化控制。

（4）酶的利用效率高，单位酶催化的底物量增加，用酶量减少。

（5）比水溶性酶更适合于多酶反应。

有了固定化酶，工业生产便可实现大批量、连续化、自动化。本实验中的尼龙固定化木瓜蛋白酶属共价键结合法。目前已建立了各种各样的酶固定化方法，按所用的载体和操作方法的差异，一般可分为载体结合法、包埋法及交联法。其中，载体结合法又可根据结合形式的不同可以分为物理吸附法、离子结合法和共价结合法三种。包埋法也可分为网格型和微囊型两种。

本实验分别介绍两种酶的固定化方法：交联法和包埋法。

交联法：依靠双功能团试剂使酶分子之间发生交联凝集成网状结构，使之不溶于水从而形成固定化酶。常采用的双功能团试剂有戊二醛、顺丁烯二酸酐等。酶蛋白的游离氨基、酚基、咪唑基及巯基均可参与交联反应。本实验采用尼龙固定化木瓜蛋白酶。尼龙长链中的酰胺键经HCl水解后，可产生游离的-NH基，在一定条件下与双功能试剂戊二醛中的一个-CHO基缩合，戊二醛中的另一个-CHO基则与酶中的游离氨基缩合，形成尼龙（载体)-戊二醛（交联剂)-酶，即尼龙固定化酶。

包埋法：酶被包裹在凝胶的细格子中或被半透明性的聚合物膜包围而成为格子型和微胶囊型两种固定化酶。包埋法制备固定化酶除包埋水溶性酶外还常包埋细胞，制成固定化细胞，例如可用明胶及戊二醛包埋具有青霉素酰化酶活力的菌体，可连续水解氨基青霉素，工业生产6-氨基青霉烷酸。本试验选用海藻酸钠对木聚糖酶进行包埋固定。

3.实验材料、仪器和试剂

（1）材料

尼龙布（86或66），140目，剪成3cm×3cm。

（2）仪器

①恒温水浴锅。

②紫外分光光度计。

③冰箱。

（3）试剂

①18.6%CaCl₂溶液。

②甲醇溶液。

③3.65mol/LHCl溶液。

④0.2mol/L硼酸缓冲液（pH8.5）。

⑤5%戊二醛溶液：用0.2mol/L硼酸缓冲液配制，pH8.5。

⑥0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）。

⑦1mg/mL木瓜蛋白酶溶液。

⑧0.5mol/LNaCl溶液。

⑨0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.2）。

⑩激活剂：用0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.2）配制，含20mmol/L半胱氨酸、1mmol/L EDTA的混合液。

輥輯訛0.5%酪蛋白溶液：用0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.2）配制。

輥輰訛10%三氯乙酸（TCA）溶液。

4.操作步骤

（1）固定化酶的制备

①每组取5块尼龙布洗净、晾干，浸入含18.6%CaCl₂溶液和18.6%水的甲醇溶液中，在室温下保温10秒左右，并轻轻搅拌至尼龙布发粘。取出后用水冲去污物，用吸水纸吸干。

②将尼龙布用3.65mol/LHCI溶液在室温下水解45分钟，用水洗至pH值中性。

③将尼龙布用5%戊二醛溶液在室温下浸泡偶联20分钟。

④取出尼龙布，用0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）反复洗涤，洗去多余的戊二醛，吸干之后，立即用酶液（0.5～1mg/mL)在4℃下固定3.5小时（酶液用量每块尼龙布不宜超过0.8ml。(www.chuimin.cn)

⑤从酶液中取出尼龙布（保留残余酶液作测定用），用0.5mol/LNaCl溶液（用0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.2）配制），洗去多余的酶蛋白，即为尼龙固定化酶。

（2）酶活力测定

①溶液酶活力测定：取0.2ml酶液，加入1.8ml激活剂，于37℃下预热10分钟，加入37℃预热的0.5%酪蛋白溶液1ml，准确反应10分钟，然后加入10%三氯乙酸溶液2.0ml终止酶反应。对照管先加入10%三氯乙酸溶液，后加酪蛋白溶液，其他与测定管相同，以4000r/min的转速离心5分钟或过滤，取其上清液于波长280nm处测定消光值。

在上述条件下，每10分钟增加0.001个消光值为1个酶单位（U）（以下同）。

②残留酶活力测定：方法同溶液酶活力测定。

③固定化酶活力测定：取一块尼龙布固定化酶，加入2.0ml激活剂，其余步骤与溶液酶测定相同。

5.结果计算

固定化酶总活力活力回收=——×100%

溶液酶总活力

固定化酶总活力数相对活力=——×100%

溶液酶总活力数-残留酶活力数

6.注意事项

（1）尼龙布的处理是本实验成败的关键，既要让其充分地活化，又不能使其破碎。

（2）固定化酶溶液浓度最好为0.5～1mg/ml，对每块尼龙布用量不宜超过0.8ml。

（3）酶活性测定的反应时间一定要准确。

二、木聚糖酶的固定化

1.实验目的（同木瓜蛋白酶的固定化实验）

2.实验原理（同木瓜蛋白酶的固定化实验）

3.实验材料、仪器和试剂

（1）材料

菌种：黑曲霉。

（2）仪器

752型分光光度计；水浴锅；电炉；电子天平；干燥箱；抽滤器；酸度计；50ml注射器；试管烧杯等。

（3）试剂

3%的海藻酸钠溶液，3%明胶溶液，磷酸一柠檬酸缓冲液（pH5.0)，DNS溶液，1%氯化钙，5%戊二醛，生理盐水，HCl，NaOH

（4）试剂配制方法

DNS溶液的配制：称取3.15gDNS于131ml2摩尔/升NaOH溶液中（即NaOH10.48克溶于131ml蒸馏水中），加入酒石酸钾钠的热溶液（91g酒石酸钾钠溶于250ml蒸馏水），再加2.5g苯酚和2.5g亚硫酸钠，溶解后冷却定容到500ml，贮于棕色瓶中3天后使用。

海藻酸钠、明胶用pH5.0的磷酸一柠檬酸缓冲液溶解。

4.操作步骤

（1）取原酶液15ml与150ml的3%的海藻酸钠溶液混合搅拌。

（2）加入150ml3%明胶溶液搅拌均匀。

（3）用6号注射器针头以15cm高度用力均匀向下注入1%的氯化钙溶液中，立刻形成光滑的微球。

（4）冰箱放置30分钟。

（5）抽滤滤出微球，置人30℃5%的戊二醛中，硬化1小时。

（6）待微球达到一定硬度后，用生理盐水反复洗涤，洗出的固定化酶于冰箱存放。

（7）取微球4～5粒按测定原酶液的方法测量其最适温度、最适pH值、温度稳定性及pH稳定性。以每分钟产生1μmol木糖作为1个酶活力单位（U)来计算酶活。

（8）取微球20粒放入提前烘干和称重的培养皿中，80℃放置至烘干，称重，计算4～5粒固定化的酶含量。

5.结果

（1）Excel作图比较原酶与固定化酶的酶学性质。

（2）讨论酶固定化的优点及意义。

酶的固定化方法及原理-木瓜蛋白酶实验

相关推荐