生物技术制药实验：组织块培养技术

2023-12-07 百科知识版权反馈

【摘要】：实验二十九组织块培养技术1.实验目的学会组织块的培养技术，观察组织块的组织学生长行为。组织块法特别适合于组织量少的原代培养，但组织块培养时细胞生长较慢，耗时较长。注意有无污染，已贴壁的组织块边缘有无细胞“长”出。组织块的取材要尽可能快，以免组织块因取材时间过长引起细胞状态不好，将会导致后期培养。

实验二十九组织块培养技术

1.实验目的

（1）学会组织块的培养技术，观察组织块的组织学生长行为。

（2）通过组织块培养得到细胞培养物。

2.实验原理

组织块培养是常用的、简便易行和成功率较高的原代培养方法，即将组织剪切成小块后，接种于培养瓶。培养瓶可根据不同细胞生长的需要做适当处理。例如预先涂以胶原薄层，以利于上皮样细胞等的生长。如果原代细胞准备做组织染色、电镜等检查，可在做原代培养前先在培养瓶内放置小盖玻片，小盖玻片要清洗干净，在消毒前放置，并在放入组织块前预先用1～2滴培养液湿润瓶底，使之固定。组织块法操作简便，部分种类的组织细胞在小块贴壁培养24小时后，细胞就从组织块四周游出。但由于在反复剪切和接种过程中对组织块的损伤，并不是每个小块都能长出细胞。组织块法特别适合于组织量少的原代培养，但组织块培养时细胞生长较慢，耗时较长。

3.实验材料与试剂

新生乳鼠或胎鼠、RPMI1640培养液（含小牛血清和青霉素、链霉素）、Hanks液、75%乙醇。

4.实验仪器与器材

超净工作台、恒温培养箱、普通显微镜、倒置相差显微镜、水浴箱、离心机、解剖剪、解剖镊、眼科剪、培养皿、培养瓶、离心管、微量加样器、吸管、移液管、血细胞计数板、橡皮吸头、胶塞（盐水瓶翻口塞）、酒精灯、试管架、棉球、无菌服、口罩、帽子等。

5.实验步骤

（1）取材

取新生乳鼠1只，采用颈椎脱臼法处死，或放置-20℃冰箱片刻，使之不动后，浸入75%乙醇中浸泡2～3秒，携入超净工作台内，置于消毒培养皿中，无菌操作取材。用弯头眼科镊夹起腹部皮肤，剪开腹腔和胸腔，并剪去部分胸壁以充分暴露胸腔，用眼科镊轻轻夹起粉红色肺组织并剪下（或在腹腔背壁脊椎两侧取下肾脏）放入另一培养皿中。用Hanks液清洗，去掉血污。将取出的组织（肝、肾或肺）移入无菌的培养皿中，用Hanks液清洗，去掉血污。然后移入无菌青霉素小瓶或表面皿中，用眼科剪将组织反复剪成0.5～1立方毫米的小块，再用吸管加2~3滴细胞培养液，用吸管轻轻吹打，使组织块悬浮在培养液中。

（2）接种

用吸管分次吸取组织块悬液（吸取时注意让组织块吸在吸管端部，以免吸得过高，黏附管壁而丢失），将其均匀排在培养瓶底壁上，再缓慢地将培养瓶翻转，使培养液浸泡组织块，继续静止培养。(www.chuimin.cn)

（3）观察

组织块静止培养2～3天后，每天小心取出培养瓶置于倒置相差显微镜下进行观察（注意尽量少振摇培养液，以防组织块脱落）。注意有无污染，已贴壁的组织块边缘有无细胞“长”出。一般最先“长”出的是形态不规则的游走细胞，接着“长”出成纤维细胞或上皮细胞。说“长”实际上是从组织块移动出来的细胞，尚很少有细胞分裂，后逐渐出现细胞分裂，细胞数量增多，在组织块周围形成较大生长晕，随之细胞生长较快，可根据培养液颜色变化，补加和更换培养液，同时注意吸除漂浮的组织块。细胞生长良好时，约10～15天可长成致密单层，这时可进行传代培养。

6.注意事项

（1）自取材开始，保持所有组织细胞处于无菌条件。细胞计数可在有菌环境中进行。整个操作过程要注意无菌操作。

（2）组织块的取材要尽可能快，以免组织块因取材时间过长引起细胞状态不好，将会导致后期培养。

（3）在接种组织块时，动作也要尽可能的轻，应待组织块略干燥，能黏附于瓶壁时再使之与培养基接触，注意不能让组织块漂浮起来。

（4）在超净台中，组织细胞、培养液等不能暴露过久，以免溶液蒸发。

（5）组织块接种后1～3天，由于游出细胞数量很少，组织块的粘贴不牢固，在观察和移动过程中要注意动作轻巧，尽量不要引起液体的震荡而产生对组织块的冲击力使其漂起。

（6）对原代培养要及时观察，发现细胞游出后要照相记录。

（7）原代培养3～5天，需换液一次，去除漂浮的组织块和残留的血细胞，因为已漂浮的组织块和很多细胞破片，含有有毒物质，影响原代细胞的生长，要及时清除。

7.思考题

（1）在倒置相差显微镜下进行观察组织和细胞的生长状态有何不同？

（2）在组织块取材及接种时需要注意哪些问题？