细胞冻存与复苏实验成果

2023-12-07 百科知识版权反馈

【摘要】：实验二十七细胞的冻存与复苏1.实验目的掌握细胞冻存与复苏的操作过程。注意在细胞冻存时要遵循的原则是“慢冻快融”，即缓慢冻存，快速融化。复苏细胞时则直接将装有细胞的冻存管投入37℃~40℃热水中迅速解冻。将细胞悬液装入冻存管中。

实验二十七细胞的冻存与复苏

1.实验目的

掌握细胞冻存与复苏的操作过程。

2.实验原理

细胞冻存是保存细胞的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。而且适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用。细胞冻存时需向培养基中加入冻存保护剂——终浓度为5%～15%的甘油或二甲基亚砜（DMSO），它们可使溶液冰点降低，从而使细胞在缓慢冻结条件冻结，这样细胞内水分透出，减少了冰晶形成，从而避免细胞损伤。注意在细胞冻存时要遵循的原则是“慢冻快融”，即缓慢冻存，快速融化。采用“慢冻快融”的方法能较好地保证细胞存活。标准冷冻速度开始为每分钟-1℃～-2℃，当温度低于-25℃时可加速，达到-80℃之后可直接投入液氮内（-196℃）。复苏细胞时则直接将装有细胞的冻存管投入37℃~40℃热水中迅速解冻。

3.实验材料与试剂

培养的细胞，培养基（RPMIl640或DMEM），小牛血清，0.25%胰蛋白酶溶液，二甲基亚砜（DMSO）或甘油，0.5%台盼蓝染液，液氮。

4.实验仪器与器材

4℃冰箱，-70℃冰箱，液氮容器，微量加样器，水浴锅，离心机，冻存管，离心管等。

5.实验步骤

细胞冻存

（1）取待冻存的细胞用胰酶消化，用培养基将细胞冲洗下来。800~1000r/min离心5分钟，弃上清收集细胞。如果是悬浮生长的细胞，则可直接离心收集细胞。

（2）加入适量冻存液（10%甘油＋90%培养基，或者10%DMSO＋90%培养基）制成细胞悬液。细胞浓度宜大，3×10⁶个/ml左右，并可适量增加小牛血清浓度至20%。

（3）将细胞悬液装入冻存管中。用胶布封裹，做好标记（写上细胞种类、传代次数、冻存时间及冻存条件等）。(www.chuimin.cn)

（4）冻存管在4℃下存放30分钟，转入-20℃1.5～2小时，再转入-70℃4～12小时，最后即可转移到液氮内（-196℃），注意进行登记。

细胞复苏

（1）调配37℃~40℃的温水。